연구과제의 최종 목표: 1) 골절에 의해 발생하는 근감소증의 분자생물학적 기전 규명 및 이에 대한 irisin 등 마이오카인의 치료효능 평가 2) 운동과 근감소증의 유전체 통합분석을 활용한 치료후보물질 도출 및 마이오카인 스크리닝 라이브러리 구축세부연구목표 1. 골절에 의한 근감소증 발생기전 연구 및 이에 대한 마이오카인의 치료효능 평가세부연구목표 2. 단...

- 근육량 및 근육기능 감소로 정의되는 근감소증은 건강수명의 단축과 일상생활 활동장애를 유발함. 현재 글로벌 제약사를 중심으로 근감소증 약물개발이 진행 중이나, 아직 승인된 약물은 없음. 근감소증 발생은 단백질 항상성 불균형과 더불어 염증 등의 복합적 요소들이 관여하므로 효과적인 치료제 개발을 위해서는 시스템 수준의 기전연구가 반드시 필요함.- 장내 항상성...

표적검증 / 기전연구 / 효능평가로 이어지는 운동의학융합연구 1차년도> TLR4 활성화에 의한 근감소증 발생기전 연구 - 근감소성 비만에 의한 내독소 증가 및 이에 대한 운동의 억제효과 관찰 - 급성 근육손상에서 TLR4/MD2 활성화 기전 검색 - Irisin에 의한 TLR4/MD2 활성화 억제 및 급성 근육손상 억제효과 관찰 - 2차년도 연구를 위한 FNDC5 KO 마우스 모델 구축 - 3차년도 연구를 위한 노화 마우스 모델 구축 2차년도> FNDC5 결핍 마우스를 활용한 장-근육-지방조직 염증 조절 기전연구 - FNDC5 KO 마우스를 이용한 irisin의 근육 항상성 제어 연구 - 3D 세포배양 co-culture 모델에서 근육-지방세포 상호작용 연구 - 유전체 정보 분석을 통한 irisin-TLR4-근감소증 상관관계 분석 3차년도> 재조합 irisin 투여에 의한 근감소증 치료효과 연구 - WT, FNDC5 KO 마우스에 재조합 irisin 투여 후 근감소증 개선효과 검증 - 노화 마우스 모델에 재조합 irisin 투여 후 근감소증 개선효과 검증 - Connectivity map을 활용한 근감소증 제어물질 탐색 시스템 구축 <핵심추진방법> - 근감소증 동물모델: 20주간의 고지방식이에 의한 근감소성 비만모델, 24개월령 마우스를 이용한 노화 근감소증 동물모델, 그리고 cardiotoxin의 근육주사를 통한 급성 근육손상 마우스모델을 사용하 여 TLR/MD2 활성화 측정과 irisin 효능평가 - 근육량 및 근육기능 평가를 위한 실험체계: 신진과제 수행을 통해 확립한 treadmill exercise protocol을 활용하여 지구력을 평가하고 grip strength test를 통해 악력평가. 조직염색을 통해 근육 줄기세포(Pax7+ satellite cell), 근섬유 발달(단일근섬유 면적 측정, laminin/MHC-I/MHC-II 면역염 색), 근감소증 지표(atrogene array), 단백질합성률(SUnSET법-비동위원소 puromycin을 이용한 in vivo 측정법), 단백질분해율(ubiquitin-proteasome), 신호전달경로(Akt, S6K, mTOR, IGF1, FoxO 등) 측정 - 장내 항상성 분석: 장투과성(FITC-dextran 경구투여 후 혈액 중 FITC 정량), 세포장벽(ZO-1, occludin), 혈중 내독소 측정. 장내 미생물 분석 - Primary myoblast culture system: 기존 연구를 통해 수립된 collagenase-trypsin 방법으로 근육조 직에서 전구세포를 분리 후, 1% horse serum을 5일간 처리하여 분화 유도. Myoblast에 cardiotoxin 처리를 통해 근육의 손상 및 재생에 대한 irisin-TLR4 기전에 대해 연구 - 3D co-culture system 구축: Hydrogel을 활용하여 24 well 하층에는 myoblast, 상층에는 adipocyte를 배양하여 조직 간 상호작용 관찰 - 세포 대사기능 분석: 근감소증과 밀접한 관련이 있는 자가포식작용과 미토콘드리아 기능 등의 세포 대사기능 분석은 본 연구실과 전남대학교 약학대학에 구비된 Seahorse bioanalyzer와 Lionheart FX 등의 고가장비를 활용 - 생물정보학적 분석: 본 연구실에서 보유한 분석법을 활용. Gene Expression Omnibus에서 근감소 증 환자 dataset을 3개 이상 추출하여 공통적으로 상향·하향조절 유전자를 선택 후 HumanNet와 MCODE 알고리즘을 활용해 Cytoscape 기반 네트워크 구축. WT과 FNDC5 결핍 마우스의 근육조직 도 동일하게 분석하여 통합된 기능적 네트워크 지도 작성. 구축한 유전자 발현 패턴을 Connectivity Map에 입력하여 irisin의 작용과 유사한 유전자변화를 유도하는 bioactive small molecule 발굴

최종연구목표: 고지방식이를 투여한 gasdermin D 유전자 결핍 마우스를 활용하여 인플라마좀 활성화와 지방조직 파이롭토시스에 의한 대사성질환 발생 기전 규명 ▶ 연구가설: 고지방식이 동물모델에서 gasdermin D의 결핍에 의해 파이롭토시스(염증성 세포사멸)가 감소되며 이에 따른 지방조직 대사변화로 인해 인슐린 저항성 등의 전신 대사가 개선됨. ▷ 연구내용1: 지방세포 분화과정 동안 gasdermin D의 활성 변화 관찰 및 gasdermin D에 의한 지방분화 제어 기전 연구 - 지방전구세포에 insulin, IBMX, dexamethasone 등을 포함한 지방분화유도 배지 처리 후 이틀 간격으로 유전자 및 단백질 수준에서 gasdermin D 측정(분화 0일부터 8일까지) - Gasdermin D 유전자 결핍 마우스와 정상 마우스로부터 분리한 지방전구세포의 분화율 및 분화관련 인자(C/EBPα, PPARγ 등) 측정 ▷ 연구내용2: 비만동물모델의 지방조직에서 gasdermin D 활성화 및 파이롭토시스 발생 기전 연구 - 고지방식이(60% 지방)를 8주령부터 14주간 투여한 마우스의 피하지방 및 복부지방에서 gasdermin D의 발현 및 caspase-1 FLICA, TUNEL 염색, LDH 측정 등을 통한 파이롭토시스 발생 관찰 - 마우스에서 분리한 지방세포와 면역세포에 LPS, TNFα, 포화지방산 처리에 의한 gasdermin D 활성화 및 파이롭토시스 발생 기전 연구 ▷ 연구내용3: Gasdermin D 유전자 결핍 마우스에 고지방식이 투여 후 인슐린 저항성 등 대사질환 발생에 미치는 영향 연구 - Gasdermin D 유전자 결핍 마우스와 정상 마우스에 14주간 고지방식이를 투여 후 당부하시험과 인슐린부하실험을 통해 전신 인슐린 저항성 측정 - 마우스 희생 시 채취한 혈액에서 염증성 사이토카인과 adipokine 측정 - 마우스 희생 시 채취한 지방조직에서 대사관련 인자 측정(대사관련 효소 활성, 미토콘드리아 기능, 자가포식작용, 인슐린에 의한 Akt 경로 활성화 등) ▷ 연구내용4: Gasdermin D가 결핍된 마우스와 정상 마우스의 지방조직에서 인플라마좀 활성화, 파이롭토시스, 염증 및 대사조절 작용 비교 및 기전 연구 - Gasdermin D 유전자 결핍 마우스와 정상 마우스에 14주간 고지방식이를 투여 후 마우스 희생 시 채취한 지방조직에서 gasdermin D의 발현과 파이롭토시스 활성화 측정 - 마우스 희생 시 채취한 지방조직에서 염증관련 인자 측정(cytokine 발현, M1/M2 대식세포 관련 인자, F4/80 발현 등) - 마우스 희생 시 채취한 지방조직에서 대사조절 인자 측정(당/지방대사 관련 효소, adipokine 등) ▷ 연구내용5: Gene Expression Omnibus에서 추출한 데이터의 생물정보학적 분석을 통한 gasdermin D 관련 기능적 유전자 네트워크 구축 - 비만한 환자의 microarray 결과를 R program으로 분석하여 유의하게 변화한 유전자(DEG) 추출 - DEG를 기반으로 gene ontology 및 functional network analysis 수행