보험한약제제의 폐섬유화증 적응증 확대를 위한 효력시험 기반 구축 및 새로운 조성물 도출 연구
?최종연구 목표 ? 호흡기질환 보험 한약제제 중 특발성 폐섬유화로 적응증 확대가 가능한 한약제제를 도출하고 이들을 구성하는 단미제를 중심으로 폐섬유화증 치료를 위한 새로운 한약 조성물을 제시함.
특발성 폐섬유화증
한약제제
건강보험
자가포식
블레오마이신
신조성물
신약재창출
2
주관|
2017년 2월-2020년 2월
|100,000,000원
암 악액질을 억제하는 새로운 처방의 도출과 전임상 연구
□ 1차년도
○ 면역세포주인 Raw 264.7 cell와 다양한 종류의 세포주를 이용함. 삼출건비탕을 구성하는 각각의 한약제제 extract를 처리한 후, 이들에 의한 염증성 싸이토카인 발현 억제를 확인
○ 근육 세포주인 sol 8 cell을 이용함. 삼출건비탕을 구성하는 각각의 한약제제 extract를 처리한 후, 이들에 의한 autophagy 억제 여부를 western blot등으로 확인
□ 2차년도
○ 최적의 효과를 보이는 한약제제를 다양한 배합으로 새로운 제제를 만들고, 세포주를 이용하여 항염증과 함 autophagy 효과가 뛰어난 배합을 도출
○ 암의 의한 악액질 마우스 모델(Lewis lung carcinoma cell xenograft)을 이용하여, 선정된 한약제 제를 처리한 후, 항 악액질 효과를 평가함.
○ 한약제제에 의한 종양, 가자미근의 변화, 혈중의 염증인자 변화등을 조사함.
○ 악액질 마우스모델결과를 바탕으로 최적의 복합제제 도출.
□ 3차년도
○ 새로운 한약제제가 TAM의 싸이토카인 생성등에 미치는 효과를 조사함.
○ 가자미 근 세포에서의 autophagy 변화 여부를 가자미 근 조직에 대한 immunohistochemistry 방법과 western blot등의 방법을 이용하여 분석 평가함
본 과제는 삼출건비탕이 종양 악액질의 진행을 늦추는 효과가 있는지 동물모델에서 확인하는 연구임. 중개연구 근거를 수립해 양-한방 융합을 촉진하고, 진행암에서 주로 나타나는 악액질 상태 개선과 관리를 목표로 함.
C57BL/6 생쥐에 Lewis lung carcinoma (LLC) cell을 피하주입하고, 한약물 조기투여·후기투여로 분리 투여함. 단독투여 후 일정 효과 약물은 항암화학요법과 병용하여 cachexia 지표(체중·음식섭취량, 가자미근 무게, IL-1/IL-6/TNF-a/MCP-1 유전자발현·혈중 농도, 혈청 생화학 등)를 28일 후 sacrifice로 평가함. 효과가 입증될 경우 종양 악액질에 대한 Bench to Bedside 근거와 임상 적용·건강보험 시장 확대에 기여 가능함.
본 연구는 크게 in vitro 실험 및 in vivo 실험 두 단계로 나누어 수행한다. in vitro 실험에서는 인간비소세포폐암 세포주인 A549 cell 및 생쥐의 비소세포폐암 세포주인 Lewis lung carcinoma (LLC) cell을 이용하여 진행하는데 우선 MTT assay를 통하여 in vitro 실험에 적절한 조협의 농도를 결정하고 조협이 종양세포의 apoptosis에 미치는 효과를 살펴보게 되는데, Morphological examination, Annexin V 및 PI(propidium iodide) 염색을 시행한 후 cytometry로 Quantification of apoptotic cells 수행 및 각 apoptosis 단계에서 Caspase assay, Bcl-2, pro-caspase-9,3, activated caspase-9,3 등에 대한 western blot 및 rt-PCR 분석을 수행한다. 이후 조협의 단독 혹은 병용투여로 인한 비소세포폐암 Cell Cycle Arrest 효과를 PI 염색된 세포들의 주기별 비율을 flow cytometry로 분석하고 각 세포주기조절 연관 단백질 및 유전자를 western blot 및 rt-PCR로 분석한다. 또한 비소세포폐암 세포의 침윤 및 이주 억제에 미치는 영향을 Cell invasion assay, Scratch motility assay, Cell migration assay, Cell attachment assay 등을 통하여 관찰하여 국소 침윤 및 원격전이에 대한 in vitro 실험을 수행한다. in vivo 실험에서는 LLC cell을 C57BL/6 쥐의 right hind limb에 주사시킨 tumor cell bearing 모델과 C57BL/6 쥐의 꼬리정맥에 주사시켜 폐전이를 유발시키는 metastasis 모델을 이용하는데 LLC cell에는 NF-kB.GFP.LUC reporter plasmid(pNGL)을 transfection 시킨 후 in-vivo bioluminescent imaging을 통해 생존상태로 조협의 투여로 인한 시간의 경과에 따른 tumor burden의 변화를 관찰하고자 한다. tumor cell bearing model에서는 희생 후 폐의 무게 및 VEGF 상태를 관찰하고자 하며 metastasis model에서는 조협의 효과 확인과 함께 그 기전이 전사인자인 Nrf2와 주로 관계되는지를 확인하기 위하여 wild type C57BL/6 생쥐 및 Nrf2 knock-out된 C57BL/6 생쥐를 이용하여 비교하고자 한다.