재조합 아데노부속바이러스(rAAV, recombinant adeno-associated virus)는 비병원성, 장기간의 유전자 도입체 발현, 광범위한 조직/세포 표적 특이성(tropism), 분열 및 비분열 세포 모두를 감염(transduce)시킬 수 있다는 점 때문에 체내(in vivo) 유전자 치료에서 널리 사용되는 벡터이다. 그러나 포유류 세포의 일과성(transient) 형질전환을 통한 rAAV 벡터 생산은 통상적으로 채워진(filled) 캡시드가 전체 캡시드에 차지하는 비율이 낮으며(총 생산 캡시드의 약 1–30%), 약하게 채워진 정도가 나타난다. 우리가 이전에 개발한 rAAV2/5 생산의 기전적 모델 분석에서는 이러한 낮은 충전(fill) 비율이 캡시드 합성과 바이러스 DNA 복제 사이의 조율이 부적절한 시간적 동기화(timeline) 때문이며, 또한 Rep 단백질에 의한 후반 단계의 캡시드 형성 억제가 원인으로 해석되었다. 여기서는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포에 대한 다중 투여(multiple dosing) 형질전환을 이용하여, 전체 Rep 단백질의 발현 동역학과 이것이 rAAV2/5 생산의 핵심 단계들에 미치는 영향을 정량화함으로써 모델을 확장하였다. 그 결과, 사전에 형성된 빈(empty) 캡시드의 가용성과 세포당 바이러스 DNA 사본 수는 캡시드 충전 반응에 제한 요인이 아님을 보고한다. 그러나 Rep 단백질의 최적 발현(세포당 < 240 ± 13 ag)이 상류 단계에서 충전된 캡시드 집단의 농축(> 12%의 전체 캡시드/세포)을 가능하게 한다. 우리의 분석은 Rep 단백질 발현을 조절함으로써 충전된 캡시드의 농축을 더욱 증가시킬 수 있으나, 이는 3중 플라스미드(triple plasmid) 형질전환에서 세포당 캡시드 역가(capsid titer)가 감소하는 대가를 치른다는 점을 시사한다. 본 연구는 rAAV2/5 벡터 게놈(vg) 생산의 규모 확장(scaling)에 내재된 한계를 규명하며, 상류 단계에서 세포당 vg 역가를 최대화하기 위해 Rep 단백질 발현을 조절할 수 있는 접근법의 필요성을 강조한다.

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