● 근감소증의 원인으로 알려진 세포 내의 자가소화(autophagy)의 감소, 염증 증가, 미토콘드리아 에너지 대사 및, 항산화작용의 감소에 대해, 메트포르민을 통해 기능을 상실한 미토콘드리아를 마이토좀을 통하여 제거하고 항산화 기작을 정상화시켜 근육생성을 유도한다는 가설을 세우고 본 연구를 통해 이를 규명하고자 함 [그림 1]. ● 본 가설을 증명하기 위해 아래의 3가지 연구 목표를 설정함. ● 첫째, 근감소 유사환경에 노출시킨 근육 세포에 메트포르민을 처리하고 메트포르민의 근감소 억제능을 규명함 - 근육세포주(L6)를 배양하고 6일간 분화시킨 후, H2O2 또는 TNF-α를 처리하여 근감소 유사 환경을 만든 후, 약물처리를 하지 않은 대조군, 메트포르민을 25, 50, 100μM을 처리한 실험군을 4-6일간 배양함. - 현미경을 통하여 근관발달을 관찰하고, 근감소 마커(MyHC; myosin heavy chain, Myogenin; MyoG, MAFbx; muscle atrophy F-box protein, MuRF1; muscle RING finger 1) 및 관련 신호전달 단백질의 발현량 유전자/단백질 수준에서 측정. ● 둘째, 근감소를 유발시킨 근육세포에 메트포르민을 처리하고 세포내 미토콘드리아 에너지 대사와 세포 자기소화(autophagy)의 변화를 관찰하여 메트포르민의 미토콘드리아 대사 활성화 기작을 규명함 - 근육세포주(L6)를 배양하고 6일간 분화시킨 후, H2O2 또는 TNF-α를 처리하여 근감소 유사 환경을 가하고, 대조군은 약물처리를 하지 않은 군이며, 실험군은 메트포르민 25, 50, 100μM을 처리하여 4-6일간 배양함. - 메트포르민으로 조절되는 세포 내 활성산소(reactive oxygen species; ROS)의 양을 DCFDA 형광분석을 통하여 관찰함. 항산화기작을 관찰하기 위해 Nrf2의 발현과 downstream 항산화효소인 HO-1, NQO-1의 발현 관찰, FACS를 이용한 DCFDA 형광분석은 이미 수행 경험이 있음 [그림 2]. - 10mM 포도당, 4mM L-glutamine, 2mM의 sodium pyruvate를 처리하여 산소소모율(oxygen sonsumption rate)과 세포외산성화율(excellular acidification rate; ECAR)을 측정함(Searhorse XF analyzer). ● 셋째, 노화를 가속화시킨 SAMP8 마우스 모델에 메트포르민을 투여하고 동물 모델에서 근력, 근육량, 그리고 조직학적으로 미토콘드리아의 분포를 관찰하여 메트포르민의 in vivo 근감소증 억제와 에너지 대사 간의 상관 관계를 규명함 - 메트포르민을 투여하지 않은 대조군 마우스, 메트포르민 1, 5mg/mouse을 oral gavage로 투여한 28일 간 투여한 마우스를 실험군으로 설정함. - 근감소의 치료효과를 관찰하기 위하여 약력계(grip strength machine)을 사용하여 마우스의 모든 발을 올려놓고 같은 힘으로 당겨 측정되는 힘을 악력으로 기록함. - 실험 종료 후 마우스를 안락사시켜 근육조직을 얻고 조직학적 근육 발달 정도를 관찰함. - 근육단백질을 파괴하는 유전자(Myostatin, Atrogin-1, MuRf1) 및 근육단백질을 생성하는 유전자(MyoD, Myognin-1)의 발현양 변화를 단백질 수준에서 관찰함. 또한, 실험동물에서의 세포 내 에너지 대사를 형광 IHC를 이용하여 관찰함.

● 근감소증의 원인으로 알려진 세포 내의 자가소화(autophagy)의 감소, 염증 증가, 미토콘드리아 에너지 대사 및, 항산화작용의 감소에 대해, 메트포르민을 통해 기능을 상실한 미토콘드리아를 마이토좀을 통하여 제거하고 항산화 기작을 정상화시켜 근육생성을 유도한다는 가설을 세우고 본 연구를 통해 이를 규명하고자 함 [그림 1]. ● 본 가설을 증명하기 위해 아래의 3가지 연구 목표를 설정함. ● 첫째, 근감소 유사환경에 노출시킨 근육 세포에 메트포르민을 처리하고 메트포르민의 근감소 억제능을 규명함 - 근육세포주(L6)를 배양하고 6일간 분화시킨 후, H2O2 또는 TNF-α를 처리하여 근감소 유사 환경을 만든 후, 약물처리를 하지 않은 대조군, 메트포르민을 25, 50, 100μM을 처리한 실험군을 4-6일간 배양함. - 현미경을 통하여 근관발달을 관찰하고, 근감소 마커(MyHC; myosin heavy chain, Myogenin; MyoG, MAFbx; muscle atrophy F-box protein, MuRF1; muscle RING finger 1) 및 관련 신호전달 단백질의 발현량 유전자/단백질 수준에서 측정. ● 둘째, 근감소를 유발시킨 근육세포에 메트포르민을 처리하고 세포내 미토콘드리아 에너지 대사와 세포 자기소화(autophagy)의 변화를 관찰하여 메트포르민의 미토콘드리아 대사 활성화 기작을 규명함 - 근육세포주(L6)를 배양하고 6일간 분화시킨 후, H2O2 또는 TNF-α를 처리하여 근감소 유사 환경을 가하고, 대조군은 약물처리를 하지 않은 군이며, 실험군은 메트포르민 25, 50, 100μM을 처리하여 4-6일간 배양함. - 메트포르민으로 조절되는 세포 내 활성산소(reactive oxygen species; ROS)의 양을 DCFDA 형광분석을 통하여 관찰함. 항산화기작을 관찰하기 위해 Nrf2의 발현과 downstream 항산화효소인 HO-1, NQO-1의 발현 관찰, FACS를 이용한 DCFDA 형광분석은 이미 수행 경험이 있음 [그림 2]. - 10mM 포도당, 4mM L-glutamine, 2mM의 sodium pyruvate를 처리하여 산소소모율(oxygen sonsumption rate)과 세포외산성화율(excellular acidification rate; ECAR)을 측정함(Searhorse XF analyzer). ● 셋째, 노화를 가속화시킨 SAMP8 마우스 모델에 메트포르민을 투여하고 동물 모델에서 근력, 근육량, 그리고 조직학적으로 미토콘드리아의 분포를 관찰하여 메트포르민의 in vivo 근감소증 억제와 에너지 대사 간의 상관 관계를 규명함 - 메트포르민을 투여하지 않은 대조군 마우스, 메트포르민 1, 5mg/mouse을 oral gavage로 투여한 28일 간 투여한 마우스를 실험군으로 설정함. - 근감소의 치료효과를 관찰하기 위하여 약력계(grip strength machine)을 사용하여 마우스의 모든 발을 올려놓고 같은 힘으로 당겨 측정되는 힘을 악력으로 기록함. - 실험 종료 후 마우스를 안락사시켜 근육조직을 얻고 조직학적 근육 발달 정도를 관찰함. - 근육단백질을 파괴하는 유전자(Myostatin, Atrogin-1, MuRf1) 및 근육단백질을 생성하는 유전자(MyoD, Myognin-1)의 발현양 변화를 단백질 수준에서 관찰함. 또한, 실험동물에서의 세포 내 에너지 대사를 형광 IHC를 이용하여 관찰함.