본 과제는 생체조직 유래 탈미네랄화 골 매트릭스(Demineralized bone marix; DBM)를 분자 수준에서 변형해 물리적·기계적 특성을 조절함으로써, 세포역학 신호변환을 통한 근골격계 조직 재생을 유도하는 연구임.
연구 목표는 DBM을 조직공학 및 재생의학 생체재료로 응용 가능한 범위를 확장하고 손상된 근골격계 조직 치료용 인공장기 형성 기반을 마련하는 데 있음. 핵심 연구 내용은 DBM의 lysine 내 amine group에 Methoxy poly(ethylene glycol) (MPEG)를 그래프팅하여 MPEG 분자량과 그래프팅 밀도로 결정 도메인 형성 정도를 제어하고, ‘골수 유래 줄기세포의 골 분화 및 골 형성’ 및 ‘연골재생’ 영향을 규명하는 것임. 기대 효과는 DBM 단독으로 특성 제어 및 조직재생 효능을 증명하여 활용범위를 확장하고, 다양한 조직재생에도 적용 가능성을 높이는 데 있음.
다양한 인간만능줄기세포와 인체유래 세포외기질을 이용하여 심장유사체 제작
심장유사체 구성세포들의 특성과 유전체 발현 분석
심장유사체의 구조와 심기능 평가
유도만능줄기세포로 제작된 심질환자 특이 질환모델 확보
질병모델 심장유사체를 활용한 심장치료약물의 효능 평가
정상인의 세포로 만들어진 심장유사체를 활용한 심장독성평가
조직공학적 방법으로 새롭게 생산한 세포외기질을 기반으로 심장유사체 제작 및 기능평가
심장유사체 절편을 제작하여 심장질환 소형 동물모델에 이식하고 심장재생 치료효과 검증
심장유사체 절편을 제작하여, 심장질환 중대형 동물모델에 이식하고 심장재생 치료효과 및 안전성 평가
다양한 인간만능줄기세포와 인체유래 세포외기질을 이용하여 심장유사체 제작
심장유사체 구성세포들의 특성과 유전체 발현 분석
심장유사체의 구조와 심기능 평가
유도만능줄기세포로 제작된 심질환자 특이 질환모델 확보
질병모델 심장유사체를 활용한 심장치료약물의 효능 평가
정상인의 세포로 만들어진 심장유사체를 활용한 심장독성평가
조직공학적 방법으로 새롭게 생산한 세포외기질을 기반으로 심장유사체 제작 및 기능평가
심장유사체 절편을 제작하여 심장질환 소형 동물모델에 이식하고 심장재생 치료효과 검증
심장유사체 절편을 제작하여, 심장질환 중대형 동물모델에 이식하고 심장재생 치료효과 및 안전성 평가
연구목표 1: 유전자 비삽입성 매체를 이용한 직접전환내피세포의 제작
성체세포에서 혈관내피세포로 직접전환하는 데 있어서, 렌티바이러스나 레트로바이러스를 통한 유전자 도입방법은 잠재적으로 유전체 안정성을 변화시킬 수 있어 임상적용에 한계점을 가지고 있음. 본 연구에서는 다음과 같은 유전자 비삽입성 매체를 이용한 방법으로 인간 진피섬유아세포(HDF)로부터 직접전환내피세포(rEC)를 제작하고자 함. 1) 혈관내피세포로의 직접전환에 핵심적인 유전자인 ETV2의 변형(modified) mRNA를 도입하거나, 임상적합성을 높인 복제불가 아데노바이러스를 매개로 하여 ETV2 유전자를 과발현시켜 rEC를 제작함. 2) ETV2 유전자를 직접 사용하지 않고, ETV2를 이용한 내피세포직접전환 과정에서 가장 크게 변하는 microRNA를 이용하여 rEC를 제작함. 이렇게 제작한 rEC에서 내피세포 유전자 및 단백질 발현, 혈관신생인자, 세포생물학적 검사 등을 시행하여 최적의 rEC를 선택함.
연구목표 2: 직접전환내피세포를 캡슐화할 새로운 생체재료(AlGPM microbead)의 개발
허혈성 질환에 대한 세포치료의 임상적용에 있어서 가장 큰 문제점 중의 하나는 허혈성 조직 내로 투여한 세포의 낮은 생착률과 생존율임. 본 연구는 rEC를 세포치료에 사용하기 위하여, 세포생존은 물론 생체적합성이 좋은 생체재료를 개발하는 것임. 본 연구목표는 gelatin에 poly-glycerol sebacate (PGS)을 methacrylate를 결합시켜 GPM이라는 복합체를 만들고, 여기에 alginate를 혼합하여 microbead 형태로 만든 AlGPM microbead를 제작하는 것임. 각 조성물의 생성단계에서의 혼합비율과 최종 Alginate와 GPM의 다양한 비율의 조합을 통하여 적절한 생분해성 및 염증반응이 낮은 복합체를 제조하고, 이 특성을 분석하여, 가장 최적의 AlGPM microbead를 제작함.
연구목표 3: 세포생존 및 혈관생성에 가장 적합한 AlGPM-직접전환내피세포(AlGPM-rEC) 복합체의 결정
본 연구에서는 신혈관생성(neovascularization)에 최적화된 rEC를 적어도 세 개의 서로 다른 AlGPM microbead에 캡슐화하여, 세포의 생존 및 혈관생성 효과를 평가하고, 필요한 경우 혈관성장인자(angiogenic growth factor)를 그 안에 포함시켜 세포생존 및 혈관생성을 최대화하는 AlGPM-rEC 복합체를 제작하는 것임.
연구목표 4: AlGPM-직접전환내피세포 복합체의 허혈성질환 동물모델에 대한 치료효과 결정
본 연구에서는 연구목표 3에서 결정된 몇 가지의 AlGPM-rEC 복합체를 허혈성질환 동물모델에 주입한 후, 투여한 세포의 생존 및 혈관신생을 생리학적, 분자생물학적, 조직학적, 이미징 등의 방법 들로 평가하여, 조직재생 및 치료효과를 규명하는 것임.
연구목표 5: AlGPM-직접전환내피세포 복합체의 안전성, 장기적 세포생존 및 혈관생성 능력의 규명
본 연구의 목표는 AlGPM-rEC 복합체를 하지허혈 동물모델에 주입한 후, 12개월 이상 추적 관찰하여 장기적인 세포생존 및 안전성을 평가할 뿐 아니라 혈관생성능을 장기간에 걸쳐 평가하는 것임. 안전성 측면에서는 잠재적 종양형성 유무, 타조직 세포로의 분화가능 및 AlGPM의 생체내 분해능, 잔존여부 및 면역-염증반응을 평가함. 특히 본 연구를 통하여 rEC에 의한 장기적인 치료적 신혈관생성(therapeutic neovascularization)의 중요한 기작을 규명할 수 있을 것으로 예상함.
연구목표 1: 유전자 비삽입성 매체를 이용한 직접전환내피세포의 제작
성체세포에서 혈관내피세포로 직접전환하는 데 있어서, 렌티바이러스나 레트로바이러스를 통한 유전자 도입방법은 잠재적으로 유전체 안정성을 변화시킬 수 있어 임상적용에 한계점을 가지고 있음. 본 연구에서는 다음과 같은 유전자 비삽입성 매체를 이용한 방법으로 인간 진피섬유아세포(HDF)로부터 직접전환내피세포(rEC)를 제작하고자 함. 1) 혈관내피세포로의 직접전환에 핵심적인 유전자인 ETV2의 변형(modified) mRNA를 도입하거나, 임상적합성을 높인 복제불가 아데노바이러스를 매개로 하여 ETV2 유전자를 과발현시켜 rEC를 제작함. 2) ETV2 유전자를 직접 사용하지 않고, ETV2를 이용한 내피세포직접전환 과정에서 가장 크게 변하는 microRNA를 이용하여 rEC를 제작함. 이렇게 제작한 rEC에서 내피세포 유전자 및 단백질 발현, 혈관신생인자, 세포생물학적 검사 등을 시행하여 최적의 rEC를 선택함.
연구목표 2: 직접전환내피세포를 캡슐화할 새로운 생체재료(AlGPM microbead)의 개발
허혈성 질환에 대한 세포치료의 임상적용에 있어서 가장 큰 문제점 중의 하나는 허혈성 조직 내로 투여한 세포의 낮은 생착률과 생존율임. 본 연구는 rEC를 세포치료에 사용하기 위하여, 세포생존은 물론 생체적합성이 좋은 생체재료를 개발하는 것임. 본 연구목표는 gelatin에 poly-glycerol sebacate (PGS)을 methacrylate를 결합시켜 GPM이라는 복합체를 만들고, 여기에 alginate를 혼합하여 microbead 형태로 만든 AlGPM microbead를 제작하는 것임. 각 조성물의 생성단계에서의 혼합비율과 최종 Alginate와 GPM의 다양한 비율의 조합을 통하여 적절한 생분해성 및 염증반응이 낮은 복합체를 제조하고, 이 특성을 분석하여, 가장 최적의 AlGPM microbead를 제작함.
연구목표 3: 세포생존 및 혈관생성에 가장 적합한 AlGPM-직접전환내피세포(AlGPM-rEC) 복합체의 결정
본 연구에서는 신혈관생성(neovascularization)에 최적화된 rEC를 적어도 세 개의 서로 다른 AlGPM microbead에 캡슐화하여, 세포의 생존 및 혈관생성 효과를 평가하고, 필요한 경우 혈관성장인자(angiogenic growth factor)를 그 안에 포함시켜 세포생존 및 혈관생성을 최대화하는 AlGPM-rEC 복합체를 제작하는 것임.
연구목표 4: AlGPM-직접전환내피세포 복합체의 허혈성질환 동물모델에 대한 치료효과 결정
본 연구에서는 연구목표 3에서 결정된 몇 가지의 AlGPM-rEC 복합체를 허혈성질환 동물모델에 주입한 후, 투여한 세포의 생존 및 혈관신생을 생리학적, 분자생물학적, 조직학적, 이미징 등의 방법 들로 평가하여, 조직재생 및 치료효과를 규명하는 것임.
연구목표 5: AlGPM-직접전환내피세포 복합체의 안전성, 장기적 세포생존 및 혈관생성 능력의 규명
본 연구의 목표는 AlGPM-rEC 복합체를 하지허혈 동물모델에 주입한 후, 12개월 이상 추적 관찰하여 장기적인 세포생존 및 안전성을 평가할 뿐 아니라 혈관생성능을 장기간에 걸쳐 평가하는 것임. 안전성 측면에서는 잠재적 종양형성 유무, 타조직 세포로의 분화가능 및 AlGPM의 생체내 분해능, 잔존여부 및 면역-염증반응을 평가함. 특히 본 연구를 통하여 rEC에 의한 장기적인 치료적 신혈관생성(therapeutic neovascularization)의 중요한 기작을 규명할 수 있을 것으로 예상함.