본 연구에서의 최첨단 나노전기삼투(나노일렉트로키네틱) 기술은 오류가 없는 PCR 절차 없이 단시간 내에 DNA의 극미량 종양유전자 변이를 검출해야 하는 현재의 임상적 요구에 대한 획기적 돌파구를 제공한다. 본 연구에서는 CRISPR/dCas9의 서열 특이적 표지(labeling) 체계와 이온 농도 편광(ion concentration polarization, ICP) 메커니즘을 결합하여 표적 DNA 분자를 신속한 검출을 위해 각각의 방식으로 사전 농축하였다. dCas9의 돌연변이 특이적 결합에 의해 유발되는 이동도(mobility) 변화를 이용하여 마이크로칩에서 변이 DNA와 정상 DNA를 구별하였다. 이 기술을 바탕으로, 발암(암발생)의 지표인 EGFR DNA에서 dCas9 매개 단일 염기 치환(single base substitution, SBS)의 1분 내 검출을 성공적으로 입증하였다. 또한 ICP의 뚜렷한 사전 농축 메커니즘을 통해, 표적 변이의 농도가 0.1%에 불과하더라도 상용 임신 테스트 키트와 같이 한눈에 표적 DNA의 존재/부재를 판별할 수 있었는데, 양성은 두 줄, 음성은 한 줄로 나타났다.

본 연구에서의 최첨단 나노전기삼투(나노일렉트로키네틱) 기술은 오류가 없는 PCR 절차 없이 단시간 내에 DNA의 극미량 종양유전자 변이를 검출해야 하는 현재의 임상적 요구에 대한 획기적 돌파구를 제공한다. 본 연구에서는 CRISPR/dCas9의 서열 특이적 표지(labeling) 체계와 이온 농도 편광(ion concentration polarization, ICP) 메커니즘을 결합하여 표적 DNA 분자를 신속한 검출을 위해 각각의 방식으로 사전 농축하였다. dCas9의 돌연변이 특이적 결합에 의해 유발되는 이동도(mobility) 변화를 이용하여 마이크로칩에서 변이 DNA와 정상 DNA를 구별하였다. 이 기술을 바탕으로, 발암(암발생)의 지표인 EGFR DNA에서 dCas9 매개 단일 염기 치환(single base substitution, SBS)의 1분 내 검출을 성공적으로 입증하였다. 또한 ICP의 뚜렷한 사전 농축 메커니즘을 통해, 표적 변이의 농도가 0.1%에 불과하더라도 상용 임신 테스트 키트와 같이 한눈에 표적 DNA의 존재/부재를 판별할 수 있었는데, 양성은 두 줄, 음성은 한 줄로 나타났다.

세포 내에서 메신저 RNA(mRNA) 발현을 유지하는 데 전사와 번역의 기능적 결합은 상당한 기여를 한다. 전사 조기 종료 및 신속한 mRNA 분해는, 전사가 번역과 분리될 때 mRNA의 발현을 제한하는 것으로 알려져 있다. 여기서는, 프로모터-근접 영역에서 번역 불가능한 mRNA의 생성 자체를 억제하는 것이 전사-번역 분리에 의한 mRNA 품질 관리의 새롭게 동정된 동시에 필수적인 경로임을 보고한다. 5'-비번역영역(5'-untranslated region)에서의 초기 전사를 반영하는, mRNA의 프로모터-근접 영역은 번역이 없으면 생성되지 않는다. 전사와 번역의 분리는 전사 개시 지점으로부터 250 bp 이내에서 RNA 중합효소(RNAP)의 교통(RNAP traffic)을 유발하여, 생산적인 초기 전사를 방해한다. 프로모터-근접 영역에서 결합된 리보솜이 없는 RNAP의 제한된 공정성(processivity)은, 체내(in vivo)에서 분리된 RNAP가 평균적으로 mRNA를 80-90 bp만 신장시키는 관찰에 의해 추가로 뒷받침된다. 본 연구 결과는, 프로모터-근접 영역에서 리보솜이 RNAP과 결합하는 것이 RNAP에 의한 번역 가능한 mRNA의 효율적 합성에 중요함을 보여준다.

배경: 유전자 발현을 조절하는 것은 대사 플럭스를 최적화하기 위한 핵심 전략이다. 전사, 번역, 번역 후 수준의 조절뿐 아니라, 동적 플라스미드 복제수(PCN) 제어도 연구되어 왔다. 현재까지 개발된 동적 PCN 제어 시스템은 기점(ori) 복제 기전의 이해에 기반한 것으로, 이를 특정 복제 기점에 제한되게 하며 플라스미드 유지를 위해 항생제를 사용해야 한다는 제한이 있다. 본 연구에서는 항생제 없이 유지되는 Escherichia coli용 동적 PCN 제어 시스템을 개발하였다. 이는 플라스미드에 의해 암호화되는 필수 유전자 IF-1(infA)의 전사 수준을 조절하고, 이를 플라스미드를 보유한 숙주 세포에서 삭제함으로써 달성된다. 결과: 리포터 단백질로 GFP를 사용하여 검증한 결과, 본 시스템은 CloDF13 기점 내에서 PCN의 동적 범위를 22배로 나타냈다. 이 시스템을 이용하여 TCA 사이클의 중간체를 이타콘산으로 전환하는 cad 유전자를 담지하는 플라스미드의 최적 복제수를 규명하였다. PCN을 최적화함으로써 3 g/L의 이타콘산 생산성을 달성할 수 있었으며, 이는 대조 균주보다 5.3배 높은 수준이다. 결론: 본 시스템은 숙주 생장의 데 중요한 대사 경로들과 경쟁적 관계를 갖는 유전자들의 최적 발현 수준을 규명하기 위한 전략을 제공한다. 이 접근법은 감지 모듈 또는 필수 유전자를 치환함으로써 다른 세균 숙주에도 잠재적으로 적용될 수 있다.

CRISPR-dCas13( RNA를 유도하는 RNA 결합 단백질 )이 최근 번역 수준의 유전자 발현 조절자로 활용되었음에도 불구하고, 상세한 특성화의 부재로 인해 발현 수준을 정밀하게 제어하는 데에는 여전히 어려움이 있었다. 본 연구에서는 mRNA 번역을 정밀하고 예측 가능하게 하향 조절할 수 있는, 공학화된 가이드 RNA에 기반한 합성 조절형 번역 수준 CRISPR 간섭(Tl-CRISPRi) 시스템을 개발하였다. 먼저, 번역 수준에서 유전자에 대한 특이적 및 다중 억제를 가능하게 하도록 Tl-CRISPRi 시스템을 최적화하였다. 또한, Tl-CRISPRi 시스템이 전사 수준 CRISPRi(Tx-CRISPRi) 시스템보다 다중유전자 오페론(polycistronic operon)에서 각 유전자를 독립적으로 조절하는 데 더 적합함을 보여주었다. 더 나아가, Escherichia coli 및 Vibrio natriegens에서 다양한 유전자를 조절 가능하고 예측 가능하게 억제하도록 가이드 RNA의 핸들 구조를 공학적으로 설계하였다. 조절 가능 Tl-CRISPRi 시스템을 대사 플럭스를 전환하여 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 생산을 14.2배 증가시키는 데 적용하였으며, 이는 RNA 표적화 기전을 기반으로 한 미생물 세포공장(microbial cell factories)에서 플럭스 최적화를 수행하는 데 본 시스템이 유용함을 시사한다.

배경: 당밀(sugarcane molasses)은 자당(sucrose), 포도당(glucose), 과당(fructose)을 풍부하게 포함하고 있어, 풍부한 공급원과 낮은 비용으로 인해 산업 발효를 위한 유망한 탄소원이다. 그러나 여러 당을 동시에 이용하는 과정에서 발생하는 문제와 탄소 캐터볼라이트 억제(carbon catabolite repression, CCR)가 도전 과제로 제기된다. 영양학적 함량에도 불구하고, W 균주를 제외한 Escherichia coli에서의 자당 대사는 여전히 충분히 이해되지 않아, 미생물 발효에의 활용을 저해한다. 본 연구에서는 E. coli W를 유전적으로 설계하여 당 소비 속도를 향상시키고 CCR을 극복하고자 하였다. 이는 합성적으로 설계된 csc operon의 통합과 포도당 및 과당의 공동 이용(co-utilization) 경로의 최적화로 달성하였다. 이러한 개선은 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 생산을 위한 사탕수수 당밀의 효율적 이용을 가능하게 하며, 지속 가능한 생화학적 생산 공정에 기여한다. 결과: 본 연구에서는 E. coli W에서의 당 대사와 관련된 문제를 해결하고, 자당 소비를 증진하며 포도당-과당 공동 이용을 개선하는 데 초점을 맞추었다. 자당 이용 시스템에 대한 표적 공학을 통해 csc operon 구성요소인 cscB, cscK, cscA, cscR의 발현을 조절함으로써 자당 소비 속도를 가속하였다. 그 결과, cscR을 삭제하고 csc 유전자를 단일 오페론 내에서 단일전사(monocistronic)로 발현시키면, 유의미한 성장 부담 없이 최적의 자당 이용이 가능함을 확인하였다. 또한 FruR과 과당 PTS 조절 유전체(fructose PTS regulon) 사이의 결합 동역학(binding dynamics)을 조절하여 과당 가터볼라이트 억제를 완화함으로써, 포도당과 과당의 거의 동등한 공동 이용을 구현하였다. 공학적으로 설계한 균주의 산업적 적용 가능성을 검증하기 위해, 사탕수수 당밀로부터 3-HP 생산을 수행하였다. 이종(heterologous) 유전자의 도입과 대사 경로 최적화를 통해, 선행 연구에 비해 3-HP 역가(titer)를 향상시켰다. 아울러, 글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gapA)의 억제는 탄소 흐름 재분배(carbon flux redistribution)를 돕고, 당밀의 3-HP로의 전환을 향상시킨다. 결론: 자당 대사에 존재하는 제한에도 불구하고, 사탕수수 당밀을 능숙하게 이용하도록 재설계된 E. coli W 균주는 산업 발효를 위한 유용한 자원이다. 합성 csc operon은 자당 소비를 증진시키고, CCR을 완화함으로써 포도당-과당 공동 이용을 개선한다. 이러한 개선과 gapA의 억제를 함께 고려할 때, 사탕수수 당밀을 3-HP로 효율적으로 전환하여 산업 응용에서의 자당 및 과당 대사 한계를 해결하고자 한다.

대사 경로에서 플럭스 재분배를 위해서는 유전자 발현의 정밀한 제어가 필수적이다. CRISPR 간섭(CRISPRi) 시스템은 전사 수준에서 유전자 발현을 효과적으로 억제할 수 있으나, 특이성을 잃거나 세포 독성이 증가하지 않으면서 발현 수준을 정밀하게 제어하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있다. 본 연구에서는 다양한 수준에서 전사 조절을 수행하는 조절 가능한 CRISPRi 시스템을 개발하였다. dCas9에 대한 결합 친화도를 조절하기 위해 반복(repeat), 테트라루프(tetraloop), 및 anti-repeat 영역을 표적하는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 라이브러리를 구축하였다. 각 스크리닝된 sgRNA는 완전 억제 상태와 비억제 상태 사이의 특정 수준에서 유전자 발현을 조절할 수 있었으며(>45배), 또한 다양한 표적 DNA 서열에 대해 모듈형 조절을 가능하게 하였다. 본 시스템을 적용하여 예측 가능한 비율로 바이올라세인(violacein) 유도체를 생산하도록 대사 플럭스를 재분배하고, 라이코펜(lycopene) 생산을 최적화하였다. 이 시스템은 대사공학 및 합성생물학에서의 플럭스 최적화 과정을 가속하는 데 도움이 될 것이다.