인체피부조직 유래 연부조직 mADM 최적화 및 시작품 개발[주관연구개발기관(도프)]인체피부조직 유래 연부조직 mADM 최적화 및 시작품 개발[공동연구개발기관1(경상국립대학교)]3차원 세포 배양을 통한 mADM의 기능 측정[공동연구개발기관2(서울대학교병원)]간이 임상연구를 통한 치료효과 검증 [신뢰성평가기관(한국건설생활환경시험연구원)]mADM의 종양원성 평가

본 과제는 인체피부조직 유래 연부조직 mADM을 만들어 연부조직 결손을 채우는 재생 치료의 가능성을 확인하는 연구임. 연구 목표는 mADM 제조 공정(초임계 추출계획, 제형 선정)과 유효성/안전성 평가계획을 수립하는 데 있음. 핵심 연구 내용은 mADM 제형 결정을 위한 파일럿 시험, 세포 골격 염색 및 구조 분석을 통한 세포 골격·증식 조절 능력 검증, 연부조직 결손 동물모델 설계와 소동물 피하이식 유효성 평가(조직학적 분석, 미세혈관 형성 분석), 체내 생분해도 평가 및 L-929 마우스 섬유아세포 세포독성 공인시험 수행임. 기대 효과는 연부조직 충전재에 적합한 mADM 제조 노하우 축적, Pilot Scale 샘플 제작 조건 설정, 동물실험 결과 예측 및 mADM 농도·제형 초기 조건 설정 기여임.

인체피부조직 유래 연부조직 mADM 제조 공정 확립 및 유효성/안전성 평가[주관연구개발기관(도프)]인체피부조직 유래 연부조직 mADM 제조 공정 확립[공동연구개발기관1(경상국립대학교)]mADM의 세포 내 신호전달 경로 분석[공동연구개발기관2(서울대학교병원)]중동물을 이용한 유효성 및 적정 제형 평가[신뢰성평가기관(한국건설생활환경시험연구원)]mADM의 발열성...

총 3 단계로 나누어 단계별 추진 절차 및 전략을 수립함. 1단계로 miR-223-3p의 혈관내피세포 senescence 제어 기전 분석, 2단계로 TLR4-miR-223-3p double knockout 마우스, CS를 이용한 COPD/emphysema 모델, Elastase 저해제를 이용한 COPD/emphysema 모델, 연령이 높은 노화 마우스 모델 등 다양한 실험 동물 모델을 활용하여 miR-223-3p의 혈관내피세포 senescence 조절 기전 규명, 3단계로 miR-223-3p 전사인자 Sox9 활성 조절을 통한 miR-223-3p의 혈관 내피세포 senescence 조절 능력 및 COPD/emphysema 제어 규명. 1) miR-223-3p의 혈관내피세포 senescence 조절 기전 분석 1-1CSE 처리를 통해 senescence를 유도한 혈관내피세포를 이용하여 시간, 농도에 따른 miR-223-3p, HDAC2, p16INK4A의 발현 및 SA-β-gal 염색 수준 분석과 Anti-miRNA-223-3p, miR-223-3p mimic 등을 통한 세포 증식 영향을 분석함. 1-2 사람의 폐혈관내피세포, 마우스에서 분리한 폐혈관내피세포를 이용하여 Passage 경과에 의한 혈관내피세포 senescence에서 miR-223-3p, HDAC2, p16INK4A의 발현 및 SA-β-gal 염색 수준 분석과 Anti-miRNA-223-3p, miR-223-3p mimic 등을 통한 세포 증식 영향을 분석함. 1-3 TLR4 siRNA 형질전환을 통한 혈관내피세포 senescence에서 miR-223-3p, HDAC2, p16INK4A의 발현 및 SA-β-gal 염색 수준 분석과 Anti-miRNA-223-3p, miR-223-3p mimic 등을 통한 세포 증식 영향을 분석함. 1-4 miR-223-3p 프로모터 부분을 luciferase 발현 벡터에 삽입 후 luciferase 측정을 통해 miR-223-3p의 발현 수준을 측정할 수 있는 assay를 준비함. 1-5 ChIP(Chromatin immunoprecipitation)을 통해 miR-223-3p DNA 부위에 Sox9 단백질이 결합하여 전사인자로 작동하는 것을 규명함. 2) 동물 모델을 이용한 miR-223-3p의 혈관내피세포 senescence 제어 기전 규명 2-1 TLR4-miR-223-3p double knockout 마우스를 이용하여 폐포의 불규칙한 파괴가 관찰되는 생후 3개월령 마우스의 혈관 노화와, 폐 integrity 및 폐 기능 등을 분석함. 2-2 담배 연기 노출, Elastase 저해제 주사 등을 통한 COPD/Emphysema 마우스 모델을 이용하여 Sox9 저해제 주사를 통한 혈관내피세포 senescence 억제 정도를 분석하고, 마우스의 혈관 노화와, 폐 integrity 및 폐 기능 등을 분석함. 2-3 주령이 높은, 즉 노화가 일어난 마우스를 이용하여 혈관내피세포 노화를 규명하고 Sox9 저해제 주사를 통한 혈관내피세포 senescence 억제 정도를 분석하고, 마우스의 혈관 노화와, 폐 integrity 및 폐 기능 등을 분석함. 3) 혈관 노화 제어 모델 및 치료법 개발 3-1 폐 혈관 노화 마우스는 lung integrity가 정상적으로 유지되지 않음. 노화된 혈관이 폐를 구성하는 다양한 세포에 미치는 영향을 분석하고 새로운 분자를 규명함. 3-2 세부 계획 2에서 제시하는 동물 모델의 폐 혈관내피세포의 유전자를 microarray, RNA-seq 등의 분석 등을 통해 혈관노화 라이브러리를 구축하고, 노화 질환의 마커로 가능한 분자를 제시함. 3-3 3D 바이오 프린터를 활용하여 혈관내피세포를 포함하는 혈관 모형 실험 모델을 제작할 계획임. 노화 질환 맞춤 실험 모델을 제작하여 분자 기전 및 세포의 변화를 보다 용이하게 관찰하여 혈관 노화 및 COPD/폐기종, 암 전이 등 다양한 질환의 모델을 개발하고자 함. 위 실험들을 통하여 miR-223-3p의 혈관내피세포 senescence 극복을 위한 새로운 기능 및 기전을 정립.