1. CART79b의 구조 최적화(optimization)를 통한 항종양 활성 극대화 가. 높은 항종양 활성을 유도하는 Single-chain variable fragment (scFv) 선별 - 특이적인 표적인자를 인식하도록 설계된 scFv는 CAR T cell의 항암 효능을 결정하는 핵심적인 구성 요소로, 새로운 CAR T cell 개발 시 다양한 scFv를 비교 평가하여 최적의 scFv를 선별하는 것이 중요 - 최적의 scFv를 선별하기 위해, CD79b를 인지하는 총 5종류의 scFv (클론 명칭 Polatuzumab, SN8, 4447, 4450, 2F2) 를 이용하여 CART79b를 구축 - 각각의 scFv가 내제된 CART79b의 항종양 활성을 비교 평가하여 높은 항암 효능을 보이는 Top2 scFv를 선별 - 항종양 활성 평가 항목: 세포 독성 효과, 사이토카인 발현, CAR T cell의 증식 능력 나. 효과적인 immune synapse를 유도하기 위한 최적의 hinge 선별 - 효과적인 immune synapse형성은 T 세포의 세포독성 효능을 결정하는 주요 인자이며, CAR T cell의 구성요소인 hinge 도메인은 CAR T cell과 암세포 사이의 immune synapse형성시 중요한 역할을 수행 함 - 따라서 최적의 hinge를 선별하기 위하여, 길이 및 유연성등이 특화된 3 종류의 hinge를 기존에 선별 된 Top2 CART79b에 적용 후 항종양 활성 비교 평가 - 3 종류의 hinge: CD8α hinge (flexible) / IgG4 hinge (rigid) / truncated IgG4 hinge (short) - Immune synapse 형성 평가: Confocal imaging을 통한 actin, microtubule등의 polarization 비교 2. CD79b 및 CD19을 동시에 타겟하는 이중 타겟 CAR T cell 플랫폼 구축 가. B 세포 림프종 재발 모델 구축 - CRISPR-CAS9 유전자 편집 도구를 사용하여 CD19이 Knock-out (KO) 된 미만성 거대 B 세포 림프종 세포주 구축 나. Bicistronic lentiviral vector를 이용하여 이중 타겟 CAR T cell 플랫폼 (CAR19-P2A-CAR79b) 구축 및 항종양 활성 평가