배경: 최근의 근거에 따르면 저강도 조건에서 적용되는 냉 대기 플라즈마(CAP)는 진피 섬유아세포에서 세포외기질(ECM) 단백질의 생성을 상향조절하고 경피 약물 전달을 향상시킬 수 있다. 목적: 본 연구의 목적은 동물 모델에서 광노화로 유발된 주름에 대한 저강도 CAP(LICAP)의 효과를 평가하고, 사람 진피 섬유아세포에서의 ECM 단백질 발현 양상을 확인하는 데 있다. 방법: 각 군은 광노화 유도를 받은 후 치료군(LICAP, 국소 폴리락트산(PLA), 또는 둘 다)으로 배정하였다. 주름은 육안 관찰, 정량 분석 및 조직학을 통해 평가하였다. 콜라겐 I/III 및 피브로넥틴의 발현은 역전사-정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR), western blot 분석, 면역형광으로 평가하였다. 또한 헬륨 및 아르곤 가스를 사용하여 LICAP에 의해 생성되는 수성(aqueous) 반응성 종의 양도 측정하였다. 결과: 치료 모든 군에서 무처치 대조군에 비해 주름이 유의하게 감소하였다. 이러한 차이는 최소 4주 동안 유의성을 유지하였다. LICAP와 PLA 적용 이후 진피 콜라겐 밀도가 증가하였다. LICAP는 사람 진피 섬유아세포에서 ECM 단백질 발현에 대해 호메틱(hormetic) 효과를 나타냈다. 반응성 종의 생성은 이분상(biphasic) 양상을 보였으며, 초기의 선형 단계와 그에 이은 완만한 포화 단계가 관찰되었다. 초기 선형성은 아르곤 플라즈마(~15 s)보다 헬륨 플라즈마(~60 s)에서 더 오랜 시간 유지되었다. 결론: LICAP는 광손상 피부의 주름에 대한 새로운 치료 옵션으로 보인다. 이러한 치료 효과는 진피 ECM 생성에 대한 호메틱 효과와 관련이 있는 것으로 보인다.

다단계 플라즈마 식각 공정을 사용하여 실리카 미립자를 통해 서로 다른 형상의 고분자 나노니들 어레이를 제작하는 방법을 확립하였다. 각 단계의 식각 조건은 전력, 바이어스 전력, 가스 조성 및 양, 압력, 시간과 같은 식각 파라미터를 탐색하여 결정하였다. 실리카 미립자를 한 단계에서 연속적으로 식각할 때, 실리카와 고분자 간의 식각 속도 차이로 인해 실리카 미립자가 불안정해지며 불규칙한 나노니들 어레이가 형성되었다. 실리카 미립자의 직경을 감소시키고 그 결과 실리카 미립자의 질량 중심을 안쪽으로 이동시키기 위해 실리카 미립자에 대해 선택적 식각을 수행하는 안정화 단계를 도입함으로써, 실리카 마스크의 불안정성이 제거되었고 나노구조의 불규칙성이 최소화되었다. 그 결과, 고분자 나노니들 어레이를 제작하기 위한 다단계 식각 공정이 확립되었다. 각 단계의 조건에 따라 다양한 형태의 고분자 나노구조 어레이가 제작되었다.

배경: 최근의 근거에 따르면 저강도 조건에서 적용되는 냉 대기 플라즈마(CAP)는 진피 섬유아세포에서 세포외기질(ECM) 단백질의 생성을 상향조절하고 경피 약물 전달을 향상시킬 수 있다. 목적: 본 연구의 목적은 동물 모델에서 광노화로 유발된 주름에 대한 저강도 CAP(LICAP)의 효과를 평가하고, 사람 진피 섬유아세포에서의 ECM 단백질 발현 양상을 확인하는 데 있다. 방법: 각 군은 광노화 유도를 받은 후 치료군(LICAP, 국소 폴리락트산(PLA), 또는 둘 다)으로 배정하였다. 주름은 육안 관찰, 정량 분석 및 조직학을 통해 평가하였다. 콜라겐 I/III 및 피브로넥틴의 발현은 역전사-정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR), western blot 분석, 면역형광으로 평가하였다. 또한 헬륨 및 아르곤 가스를 사용하여 LICAP에 의해 생성되는 수성(aqueous) 반응성 종의 양도 측정하였다. 결과: 치료 모든 군에서 무처치 대조군에 비해 주름이 유의하게 감소하였다. 이러한 차이는 최소 4주 동안 유의성을 유지하였다. LICAP와 PLA 적용 이후 진피 콜라겐 밀도가 증가하였다. LICAP는 사람 진피 섬유아세포에서 ECM 단백질 발현에 대해 호메틱(hormetic) 효과를 나타냈다. 반응성 종의 생성은 이분상(biphasic) 양상을 보였으며, 초기의 선형 단계와 그에 이은 완만한 포화 단계가 관찰되었다. 초기 선형성은 아르곤 플라즈마(~15 s)보다 헬륨 플라즈마(~60 s)에서 더 오랜 시간 유지되었다. 결론: LICAP는 광손상 피부의 주름에 대한 새로운 치료 옵션으로 보인다. 이러한 치료 효과는 진피 ECM 생성에 대한 호메틱 효과와 관련이 있는 것으로 보인다.

다단계 플라즈마 식각 공정을 사용하여 실리카 미립자를 통해 서로 다른 형상의 고분자 나노니들 어레이를 제작하는 방법을 확립하였다. 각 단계의 식각 조건은 전력, 바이어스 전력, 가스 조성 및 양, 압력, 시간과 같은 식각 파라미터를 탐색하여 결정하였다. 실리카 미립자를 한 단계에서 연속적으로 식각할 때, 실리카와 고분자 간의 식각 속도 차이로 인해 실리카 미립자가 불안정해지며 불규칙한 나노니들 어레이가 형성되었다. 실리카 미립자의 직경을 감소시키고 그 결과 실리카 미립자의 질량 중심을 안쪽으로 이동시키기 위해 실리카 미립자에 대해 선택적 식각을 수행하는 안정화 단계를 도입함으로써, 실리카 마스크의 불안정성이 제거되었고 나노구조의 불규칙성이 최소화되었다. 그 결과, 고분자 나노니들 어레이를 제작하기 위한 다단계 식각 공정이 확립되었다. 각 단계의 조건에 따라 다양한 형태의 고분자 나노구조 어레이가 제작되었다.

표면 나노토포그래피는 다양한 세포 유형에서 세포 운명과 거동을 조절하는 줄기세포 니치의 중요한 물리적 매개변수로 보고되어 왔다. 지름이 점진적으로 증가하는 나노필라 또는 나노홀 어레이를 갖춘 기판을 고안하여 인체 배아줄기세포(hESCs), 태아 간 키나제 1 양성 중배엽 전구세포(Flk1+ MPCs), 중간엽 줄기세포(MSCs) 및 내피 집락 형성 세포(ECFCs)와 같은 다양한 세포의 반응에 미치는 표면 나노토포그래피 변화의 영향을 조사하였다. hESCs는 더 작은 나노필라 지름 범위(D = 120–170 nm)에서 비분화 마커의 발현 수준이 더 높고 더 조밀한 집락으로 조직화하려는 성향을 보였다. 세포-나노토포그래피 상호작용은 포커스 접착(focal adhesions) 형성과 세포골격 재구성을 조절하여 집락의 퍼짐을 제한하였고, 그 결과 hESC 집락에서 E-cadherin 매개 세포-세포 접착이 강화되었다. hESCs는 또한 나노패턴에서 췌장 내분비 전구세포(PDX1+ 및 NGN3+)의 클러스터를 형성하며, 이때 나노포어 지름 범위는 D = 200–300 nm였다. 나노패턴 유래 클러스터는 섬(islet)-유사 3차원 구형체(3D spheroids)를 생성하였고, 아연을 킬레이트하는 염색제 dithizone에 양성 반응을 보였다. 이 구형체는 CD200+ 내분비 세포가 30% 이상을 구성하였으며 NKX6.1 및 NKX2.2를 발현하였다. 더불어 췌장 분화의 최종 단계에서 인슐린을 발현하는 췌장 베타세포와 인슐린 및 글루카곤을 모두 발현하는 다호르몬성 세포가 획득되었다. Flk1+ MPCs는 나노패턴 기판에서 세포 증식과 집락 형성이 증가하였다. 나노필라 지름 범위(D = 200–280 nm)를 갖는 나노패턴은 심근세포 분화 및 초기 심장 표지 유전자 Mesp1의 발현을 증가시켰다. 빈큘린(vinculin)과 p-Cofilin 매개 세포골격 재구성이 관찰되었으며, 유도된 심근세포는 성숙한 심장 유전자 발현과 더불어 심장 사르코메어(cardiac sarcomeres)를 지녔다. 훨씬 더 작은 나노필라 지름 범위(D = 70±10 nm)를 갖는 나노패턴은 PDZ 결합 모티프를 가진 전사 조절 보조인자 전사공동조절인자 1(TAZ; transcriptional coactivator with PDZ binding motif)을 활성화하여, MSC의 골생성(osteogenesis)을 자극하였다. 이러한 TAZ 활성화는 나노토폴로지적 신호에 의해 매개되었고, 이는 액틴 폴리머화 및 Rho 신호 전달을 통해 이루어졌다. 또한 FAK 및 MAPK 경로도 TAZ 활성화에 관여하였다. 나노필라 지름 범위(D = 120–200 nm)를 갖는 나노필라 구조는 hECFCs의 세포 면적과 둘레를 감소시키는 한편, 필로포디아(filopodial) 돌출 성장을 증가시켰다. 빈큘린의 구조는 나노구조적 자극에 의해 조절되었다. 기울기(gradient) 나노패턴 기판은 ROCK 신호 전달을 통해 크기 특이적인 나노구조적 자극을 생성하여 hECFCs 반응의 조절에 활용하였다.

냉대기 플라즈마(cold atmospheric plasma, CAP)는 산화성 특성을 활용하여 다양한 의료 기기에서 사용되어 왔다. 최근의 연구들은 CAP가 표피를 통해 진피로 큰 친수성 분자의 전달을 촉진할 수 있음을 보여주었다. 반면, 저강도 CAP(low-intensity CAP, LICAP)라는 새로운 접근법이 개발되어 플라즈마 수준을 아(亞)독성 범위 내에서 조절함으로써 조직 손상 없이 여러 생물학적 이점을 나타내는 것으로 보고되었다. 그러나 아(亞)세포독성 조건에서 LICAP가 경표피 전달(transepidermal delivery, TED)을 향상시킬 수 있는지에 대한 능력은 충분히 조사되지 않았다. 본 연구의 목적은 LICAP 노출 시간의 아(亞)세포독성 범위를 규명하고, 그 범위 내에서 LICAP 처치가 경표피 약물 전달(TED)에 미치는 영향 및 기전을 인간 각질형성세포와 마우스 모델을 이용하여 조사하는 것이다. 시험관 내(in vitro) 연구에서는 LICAP 처치가 인간 각질형성세포(HaCaT)에서 반응성 종 생성, DNA 손상 및 세포독성 프로파일을 평가함으로써 검토되었다. 정해진 안전성 범위 내에서 기전 분석을 수행하여 LICAP-향상 전달 경로를 규명하였다. 타이트 정션 및 부착성(adhesens) 정션 유전자(tight and adherens junction genes)의 mRNA 발현과 단백질 수준을 정량하였고, HaCaT 단층(monolayer)의 초미세 형태 변화(ultramicroscopic morphology)를 조사하였다. 또한 형광 이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate, FITC)-덱스트란의 세포 내 전달도 평가하였다. 생체 내(in vivo) 연구에서는 LICAP 처리 마우스 등 피부에서 인간 표피 성장인자(human epidermal growth factor, hEGF)의 경표피 전달(TED) 및 E-cadherin 발현을 분석하였다. 세포 생존율을 70% 감소시키는 상한 안전 노출 시간(IC70 또는 LD30)은 34.3 s로 추정되었다. 안전 범위 내에서 LICAP 처치는 HaCaT 세포에서 다수의 타이트 정션 및 부착성 정션 유전자를 하향 조절하였다. 시험관 내 결과와 일관되게, 표피의 E-cadherin 발현은 감소하였고, LICAP 처리 마우스 피부의 진피에서 hEGF가 침윤(infiltration)되었다. LICAP 처치 직후 HaCaT 세포 단층에서 세포간 균열(intercellular clefts)이 관찰되었으며, LICAP 노출 후 FITC-덱스트란의 세포 내 전달이 확인되었다. 본 연구는 LICAP 처치가 hEGF의 경표피 투과(transepidermal permeation)를 향상시키며, 이는 명백히 세포간(paracellular) 경로와 세포내(transcellular) 경로 모두를 통해 이루어지는 것으로 보인다는 점을 입증하였다. 본 연구 조건에서 LICAP 처치는 시험관 내에서 낮은 안전성 우려로 TED를 촉진하기 위한 새로운 접근법일 가능성이 있다. 임상적 평가를 위해서는 추가적인 전환 연구(translational studies)가 필요하다.

배경: 한랭 대기 플라즈마(CAP)는 표적 부위에서 반응성 산소/질소 종(RONS)을 생성하며, 강도가 낮은 범위에 있을 때 호르메시스(hormesis) 관련 경로를 활성화함으로써 세포보호 효과를 유도할 수 있다. 목적: 본 연구의 목적은 동물 모델에서 광노화로 유발된 과색소침착 피부에 대한 저강도 강화 한랭 대기 플라즈마(LICAP)의 효과를 평가하는 것이다. 방법: LICAP 처리 후 세포 생존도와 RONS 생성의 변화를 측정하였다. 생체 내 연구에서는 30마리의 털 없는 생쥐에 선행 광노화를 유도한 후 배정된 치료(즉, LICAP, 국소 아스코르빅산(AA), 또는 둘 다)를 시행하였다. 치료 기간의 첫 4주(8주) 동안 자외선(UV)-B를 동시에 조사하였다. 육안 관찰 및 멜라닌 지수(MI) 측정을 통해 0, 2, 4, 6 및 8주차에 피부 색소침착의 변화를 평가하였다. 결과: RONS 생성은 포화 지점까지 선형적으로 증가하였다. 세포 생존도는 LICAP 처리에 의해 유의하게 영향을 받지 않았다. 8주차에 MI는 0주차 및 4주차의 값과 비교하여 모든 치료군에서 유의하게 감소하였다. 동시 병용 치료군의 치료 효과는 LICAP군과 AA군에 비해 우수하였다. 결론: LICAP은 광손상 피부에서 광보호와 색소 감소를 위한 새로운 양상으로 보인다. LICAP 치료와 국소 AA 적용은 상승(시너지) 효과를 나타내는 것으로 보인다.

조직공학에서 내피세포의 거동을 조절하는 미세환경 내 신호를 이해하는 것은 중요하다. 나노토포그래피의 세포학적 효과를 다수의 연구가 검토해 왔음에도 불구하고, 나노 크기의 기울기 홀 기판 위에서 배양된 사람 내피세포의 기능적 조절을 조사한 연구는 없었다. 본 연구에서는 세 가지 서로 다른 나노홀 패턴(HP)을 갖는 기울기 나노홀 기판(GHS)을 사용하여 사람 제대정맥 내피세포(HUVECs)의 세포 반응을 조사하였다. HP1에서 설명된 직경은 120-200 nm, HP2는 200-280 nm, HP3는 280-360 nm였다. 결과적으로, HP2 GHS는 HUVECs의 부착 및 증식을 증가시켰다. 또한 HP2 GHS에서 HUVECs의 초점유착 표지자에 대한 유전자 발현이 유의하게 증가하였다. in vitro 관 형성 시험에서는 Flat과 비교하여 GHS에서 프라이밍한 후 HUVECs의 관상 네트워크 형성이 향상됨이 관찰되었다. 더 나아가, 백혈구 부착 또한 홀 직경에 의존하는 방식으로 HUVECs에서 감소하였다. 요약하면, 200-280 nm 크기의 홀을 갖는 기울기 나노홀 기판은 백혈구 부착을 감소시키면서 HUVECs의 최적 증식을 달성하였다.

열 나노임프린팅 기법에 의한 그라디언트 나노패턴 제작 및 사람 내피 전구(전구세포) 집락형성세포의 반응 스크리닝. JoVE는 생물학, 의학, 화학 및 물리 연구를 가속하기 위한 동료심사(peer-reviewed) 과학 비디오 프로토콜을 출판한다. 우리의 과학 비디오 기사를 시청하라. JoVE는 과학 연구, 과학 저널 및 교육을 개선한다는 사명을 가진 세계 최고의 과학 비디오 제작 및 제공자이다. 전 세계 수천 개의 대학교, 단과대학, 병원 및 생명제약 회사에서 수백만 명의 과학자, 교육자 및 학생들이 연구, 교육 및 학습을 위해 JoVE를 사용한다.

열 나노임프린팅 기법에 의한 그라디언트 나노패턴 제작 및 인간 내피세포 집락형성세포의 반응 평가 - 비디오. JoVE는 생물학, 의학, 화학 및 물리 분야의 연구를 가속하기 위해 동료심사(peer-reviewed)를 거친 과학적 비디오 프로토콜을 제공합니다. 과학적 비디오 아티클을 시청하십시오. JoVE는 과학 연구, 과학 저널 및 교육을 개선한다는 사명을 가진 세계 최고 수준의 과학 비디오 생산 및 제공 업체입니다. 전 세계 수천 개의 대학, 대학교, 병원 및 바이오제약 회사의 수백만 명의 과학자, 교육자 및 학생들이 JoVE를 연구, 교육 및 학습에 활용하고 있습니다.