1차년도: 파킨슨병 모델을 사용하여 GBA1의 유비퀴틴화를 조절하는 E3 연결효소 TRIP12의 기능 연구. - WT 또는 A53T 알파-시누클린 과발현 SH-SY5Y 세포주에 TRIP12를 과발현 또는 KO (knockout) 시켜 TRIP12의 기능을 연구. 이를 통하여 미토콘드리아 기능, 알파 시누클린의 응집체 형성, 리소좀 pH 등의 변화에 TRIP12가 어떻게 관여하는지 확인. 2차년도: TRIP12에 의한 미토콘드리아 기능 이상의 원인 규명 및 알파-시누클린의 응집 현상과의 상호작용 연구 - 선행연구를 통해 스크리닝 한 90여개의 TRIP12 결합 단백질 중, GBA1 이외에 알파-시누클린 응집 현상을 조절하는 인자가 있는지 탐색. - Lenti-viral TRIP12 shRNA를 이용한 TRIP12 발현 감소 모델과 Adeno-viral TRIP12를 이용한 TRIP12 과발현 모델을 이용하여 GBA1 및 TRIP12-결합 단백질들의 미토콘드리아의 기능 이상/활성산소 발생 유도 현상을 확인하고 기전 연구. - 1차 배양한 신경세포에 GBA1 또는 미토콘드리아 관련 단백질에 대한 shRNA lentiviral 시스템을 사용하여 알파-시누클린 응집 및 세포 독성 등이 회복되는지 확인. 3차년도: GBA1 ubiquitination site mutant (GBA1 K293R)를 이용한 알파-시누클린 응집체 유도 세포/동물모델에서의 검증. - 1, 2차 년도 연구 기간에 GBA1 K293R을 발현시킬 수 있는 Lenti or AA V5-virus system 확립. SH-SY5Y GBA1 knockout 세포주에 GBA1 K293R site mutant를 발현시킨 후, GBA1 K293R이 정상적인 GBA1의 역할을 할 수 있는지 enzymatic assay와 리소좀 기능 실험을 통해서 연구. - 1차 배양한 신경세포에 알파-시누클린 응집체 유도 세포 모델을 만들고 GBA1 K293R을 발현 시키는 바이러스를 사용하여 활성산소 발생, 미토콘드리아 기능, 내재성 알파 시누클린 응집체 형성, 리소좀 기능 이상을 회복시키는지 확인. - microfluidic chamber를 사용하여 알파-시누클린 응집체의 transmission을 GBA1 K293R이 효과적으로 억제할 수 있는지를 검증. - 알파-시누클린 응집체 유도 마우스 모델에서 GBA1 K293R 과발현이 도파민 신경세포 사멸과 루이소체 형성, 운동이상을 회복시킬 수 있는지 연구. 4차년도: TRIP12 저해제 탐색 및 알파-시누클린 유도 세포모델에 적용. - GBA1의 유비퀴틴화에 중요한 역할을 하는 TRIP12의 E3 연결효소 활성을 조절하는 물질을 탐색. 이를 위하여 한국화합물은행의 라이브러리를 사용할 예정임. - TRIP12의 효소 활성을 조절하는 화합물을 발굴하여, GBA1 발현과 리소좀에서의 GBA1 효소 활성의 변화를 확인함. 알파-시누클린 파킨슨병 세포주와 알파-시누클린 응집체 유도 1차 배양 신경세포를 이용하여 TRIP12 저해제가 세포사멸, 루이소체 형성, 미토콘드리아 기능이상, 리소좀 기능 이상을 회복시키는지 확인. 5차년도: 알파-시누클린 유도 마우스 모델에서 TRIP12 저해제 효과 탐색. - 4차년도 연구기간 중 준비된 알파-시누클린 유도 마우스 모델에 TRIP12 활성 저해제가 주입된 샘플들을 이용하여 도파민 신경세포 사멸, 루이소제 형성, 미토콘드리아 기능이상, GBA1 유비퀴틴화, 운동기능 회복 등을 연구. - TRIP12 저해제가 동물모델에서 알파-시누클린 응집체의 transmission에 주는 영향을 탐색. - 사람에 적용할 수 있는지 확인하기 위해, 존스홉킨스 의과대학과의 공동연구를 통해서 환자유래 iPSC를 이용하여 분화시킨 도파민 신경세포를 사용하여 TRIP12의 저해재의 효과를 검증.