부피성 근육 손실(Volumetric muscle loss, VML)은 근육 조직과 혈관 모두에서 비가역적인 손실을 수반하는 중증 손상으로, 임상적으로 실행 가능한 근육 이식편 개발에 있어 주요 장벽을 형성한다. 기능적 회복을 위해서는 숙주 혈관과 기능적으로 통합될 수 있는 수축성 및 혈관성 구성요소를 모두 재구성하는 공학적 이식체가 필요하다. 본 연구에서는 SPARC(공간-키메라성, 혈장 기반, 비등방성, 그리고 전단 반응성 이식체)를 소개한다. 이는 혈장 섬유소(plasma fibrin)의 전단 유도 조립을 통해 제작한 기계적으로 이중 모달(bimodal) 섬유소 하이드로젤로서, 생체 근육의 구조적·기계적 이질성을 재현하도록 설계되었다. 제어된 미세유체 전단은 정렬된 섬유성 다발(fibrillar bundles)과 공간적으로 구배된 이중 모달 경도(bimodal stiffness) 아키텍처를 형성하며, 섬유소 다발이 조밀한 경직 영역은 근원세포(myogenic) 분화를 촉진하고, 연성 영역은 내피(endothelial) 형태형성(morphogenesis)을 촉진한다. 근아세포(myoblast)와 내피세포(endothelial cells)와의 공동배양 시, 생성된 비등방성 기질은 공간적으로 조직화된 근원세포 성숙과 내피 형태형성을 유도한다. 마우스 VML 모델에서의 생체 내 평가는 혈관화된 근육 SPARC 이식편이 근육의 구조와 기능을 회복시키며, 신생혈관형성, 근섬유 재생, 그리고 향상된 운동 회복을 촉진함을 보여준다. 공간적 기계-프로그램 설계를 통해 SPARC는 단일 이식체 내에서 조율된 근원세포 및 내피 조직 구성을 가능하게 하며, 광범위한 근육 결손의 기능적 복구를 위한 확장 가능한 바이오제조 전략을 확립한다.

흐름에서 RBC 축방향 이동(axial migration)에 필요한 조건으로 약 300 µm 정도의 유로 높이 내에 도달하는 것으로 확인되었다. 이어지는 RBC-세균 충돌은 세균의 주변부 이동(bacterial margination)을 유도하여, 채널 벽의 CDT 표면에서 이들이 효과적으로 포획되도록 하였다. CDT 내의 피브리노겐과 피브로넥틴은 다양한 세균을 포획하는 데 주로 기여하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 모든 원리를 통합한 체외 CDT 필터(eCDTF)는 시험관 내(in vitro)에서 전혈로부터 주요 항생제 내성 세균 및 사람 분변 유래 세균의 유의미한 감소를 보였다. 메티실린 내성 황색포도알균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)으로 치명적으로 감염시킨 쥐에서 세균 부하와 염증 표지자의 현저한 감소도 추가로 확인되었으며, 체외 처리 후 패혈증(bacteremia)으로부터의 회복이 나타났다. 이러한 증거는 혈액흡착(hemoadsorption) 장치에 대한 새로운 설계 원리를 제안하고, 기존 치료의 제한된 성공을 설명할 수 있을 것으로 보인다.

Joo H. Kang 및 동료 연구자들이 논문 2211149에서 보고한 바와 같이, 자가 혈액을 이용한 이식형 혈관화 공학적 혈전(IVET)은 강건한 미세모세혈관 네트워크를 형성함으로써 상처 치유를 향상시킬 수 있다. 섬유소 섬유를 정렬하고 마이크로유체 전단응력(microfluidic shear stress)을 통해 혈소판을 활성화함으로써, 공학적 혈전은 내피세포의 성숙과 혈관화를 촉진할 수 있는 중등도 강성의 미세환경을 만든다. 전층 피부 상처 모델에서 IVET 이식은 빠르고 흉터 없이 상처 회복을 돕는다.

혈관신생(vasculogenesis)을 유도하는 자가(autologous) 이식형 스캐폴드는 조직 재생에서 큰 잠재력을 보여 왔으나, 기존의 시도는 주로 지방 조직 또는 농축혈소판(platelet-rich plasma)을 이용한 세포 탑재 하이드로겔 패치에 의존해 왔으며, 이는 확장 가능한 방식으로 균일한 혈관구조를 생성하기에는 충분하지 않다. 본 연구에서는 자가 전혈(autologous whole blood)을 사용하여 이식형 혈관화된 공학적 혈전(implantable vascularized engineered thrombi; IVETs)을 제시하며, 상처 부위에서 견고한 미세모세혈관(microcapillary) 혈관망을 구축함으로써 효과적인 피부 상처 치유를 촉진한다. 미세유체(microfluidic) 전단 응력은 혈류 스트림라인 방향에 따라 응집된 피브린(fibrin) 섬유의 정렬을 유도하고 혈소판을 활성화시키며, 이 두 가지는 내피세포 성숙과 혈관화를 촉진하기에 최적인 중간 정도의 미세환경 강성을 제공한다. IVET로 처리한 설치류 등(dorsal) 피부 상처는 상처 폐쇄율(96.08 ± 1.58%), 표피 두께, 콜라겐 침착, 모낭 수, 및 호중구 침윤에서 우수한 결과를 보였는데, 이는 강화된 미세혈관 순환에 의해 가능해졌다. 또한 IVET 처치는 M2 표현형(macrophages) 대식세포를 모집함으로써 상처 치유를 가속한다.

부피성 근육 손실(Volumetric muscle loss, VML)은 근육 조직과 혈관 모두에서 비가역적인 손실을 수반하는 중증 손상으로, 임상적으로 실행 가능한 근육 이식편 개발에 있어 주요 장벽을 형성한다. 기능적 회복을 위해서는 숙주 혈관과 기능적으로 통합될 수 있는 수축성 및 혈관성 구성요소를 모두 재구성하는 공학적 이식체가 필요하다. 본 연구에서는 SPARC(공간-키메라성, 혈장 기반, 비등방성, 그리고 전단 반응성 이식체)를 소개한다. 이는 혈장 섬유소(plasma fibrin)의 전단 유도 조립을 통해 제작한 기계적으로 이중 모달(bimodal) 섬유소 하이드로젤로서, 생체 근육의 구조적·기계적 이질성을 재현하도록 설계되었다. 제어된 미세유체 전단은 정렬된 섬유성 다발(fibrillar bundles)과 공간적으로 구배된 이중 모달 경도(bimodal stiffness) 아키텍처를 형성하며, 섬유소 다발이 조밀한 경직 영역은 근원세포(myogenic) 분화를 촉진하고, 연성 영역은 내피(endothelial) 형태형성(morphogenesis)을 촉진한다. 근아세포(myoblast)와 내피세포(endothelial cells)와의 공동배양 시, 생성된 비등방성 기질은 공간적으로 조직화된 근원세포 성숙과 내피 형태형성을 유도한다. 마우스 VML 모델에서의 생체 내 평가는 혈관화된 근육 SPARC 이식편이 근육의 구조와 기능을 회복시키며, 신생혈관형성, 근섬유 재생, 그리고 향상된 운동 회복을 촉진함을 보여준다. 공간적 기계-프로그램 설계를 통해 SPARC는 단일 이식체 내에서 조율된 근원세포 및 내피 조직 구성을 가능하게 하며, 광범위한 근육 결손의 기능적 복구를 위한 확장 가능한 바이오제조 전략을 확립한다.

흐름에서 RBC 축방향 이동(axial migration)에 필요한 조건으로 약 300 µm 정도의 유로 높이 내에 도달하는 것으로 확인되었다. 이어지는 RBC-세균 충돌은 세균의 주변부 이동(bacterial margination)을 유도하여, 채널 벽의 CDT 표면에서 이들이 효과적으로 포획되도록 하였다. CDT 내의 피브리노겐과 피브로넥틴은 다양한 세균을 포획하는 데 주로 기여하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 모든 원리를 통합한 체외 CDT 필터(eCDTF)는 시험관 내(in vitro)에서 전혈로부터 주요 항생제 내성 세균 및 사람 분변 유래 세균의 유의미한 감소를 보였다. 메티실린 내성 황색포도알균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)으로 치명적으로 감염시킨 쥐에서 세균 부하와 염증 표지자의 현저한 감소도 추가로 확인되었으며, 체외 처리 후 패혈증(bacteremia)으로부터의 회복이 나타났다. 이러한 증거는 혈액흡착(hemoadsorption) 장치에 대한 새로운 설계 원리를 제안하고, 기존 치료의 제한된 성공을 설명할 수 있을 것으로 보인다.

Joo H. Kang 및 동료 연구자들이 논문 2211149에서 보고한 바와 같이, 자가 혈액을 이용한 이식형 혈관화 공학적 혈전(IVET)은 강건한 미세모세혈관 네트워크를 형성함으로써 상처 치유를 향상시킬 수 있다. 섬유소 섬유를 정렬하고 마이크로유체 전단응력(microfluidic shear stress)을 통해 혈소판을 활성화함으로써, 공학적 혈전은 내피세포의 성숙과 혈관화를 촉진할 수 있는 중등도 강성의 미세환경을 만든다. 전층 피부 상처 모델에서 IVET 이식은 빠르고 흉터 없이 상처 회복을 돕는다.

혈관신생(vasculogenesis)을 유도하는 자가(autologous) 이식형 스캐폴드는 조직 재생에서 큰 잠재력을 보여 왔으나, 기존의 시도는 주로 지방 조직 또는 농축혈소판(platelet-rich plasma)을 이용한 세포 탑재 하이드로겔 패치에 의존해 왔으며, 이는 확장 가능한 방식으로 균일한 혈관구조를 생성하기에는 충분하지 않다. 본 연구에서는 자가 전혈(autologous whole blood)을 사용하여 이식형 혈관화된 공학적 혈전(implantable vascularized engineered thrombi; IVETs)을 제시하며, 상처 부위에서 견고한 미세모세혈관(microcapillary) 혈관망을 구축함으로써 효과적인 피부 상처 치유를 촉진한다. 미세유체(microfluidic) 전단 응력은 혈류 스트림라인 방향에 따라 응집된 피브린(fibrin) 섬유의 정렬을 유도하고 혈소판을 활성화시키며, 이 두 가지는 내피세포 성숙과 혈관화를 촉진하기에 최적인 중간 정도의 미세환경 강성을 제공한다. IVET로 처리한 설치류 등(dorsal) 피부 상처는 상처 폐쇄율(96.08 ± 1.58%), 표피 두께, 콜라겐 침착, 모낭 수, 및 호중구 침윤에서 우수한 결과를 보였는데, 이는 강화된 미세혈관 순환에 의해 가능해졌다. 또한 IVET 처치는 M2 표현형(macrophages) 대식세포를 모집함으로써 상처 치유를 가속한다.

항균제 내성 병원체에 의한 혈류감염은 기존의 치료로는 치료가 어렵기 때문에 전 세계적인 우려 사항이다. 여기서는 혈액세포 유래 나노소포체( MNVs )로 감싸진 탐식성( scavenger ) 자기 나노입자를 보고하며, 이는 체외 순환 회로에서 극도로 다양한 병원체를 자기적으로 제거한다. 정량적으로, 적혈구(RBC)-MNVs 표면의 글리코포린 A(glycophorin A) 및 보체 수용체(complement receptor, CR) 1은 사람 혈액에서 인간 분변 유래 세균, 카바페넴 내성(CR) Escherichia coli, 광범위 베타-락타마분해효소 양성(ESBL-positive) E. coli, 반코마이신 중간감수성(vancomycin-intermediate) Staphylococcus aureus(VISA), 내독소, 그리고 전염증성 사이토카인을 주로 포획하는 것으로 밝혀졌다. 또한 백혈구- MNVs 의 CR3 및 CR1은 사람 혈액에서 지카(Zika), SARS-CoV-2 및 그 변이체의 바이러스 외피 단백질을 고갈시키는 데 주로 기여한다. 혈액에 옵소닌(opsonin)을 보충하면, MNVs의 CR1 및 CR3와 병원체 사이의 조합적 상호작용에 의해 병원체 제거 효율이 유의하게 증강된다. 체외 혈액 세정은 순차적으로 2회 투여함으로써 치명적으로 감염된 설치류 개체를 7일 이내에 완전 회복시키는 것이 가능함을 보여준다. 아울러, 혈구 수, 사이토카인 수준, 전사체(transcriptomics) 변화 등 면역 항상성을 반영하는 지표들이 치료 후 치명적으로 감염된 쥐의 혈액에서 회복되는 것도 확인되었다.

그림 S1은 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 세포 사멸에 대해 서로 다른 전달 방법과 sgRNA 다중화 전략이 미치는 영향을 보여준다.

DNA 손상을 유도하여 암세포 사멸을 유발하는 것은 방사선치료의 주요 목표이나, 정상세포 역시 손상된다. 본 연구에서 우리는 Cas9 엔도뉴클레아제를 사용하는 합성 가이드 RNA 4종만을 전달해도 동시에 DNA 이중가닥 절단을 효율적으로 유도할 수 있으며, 그 결과 세포 유형 특이적인 방식으로 효율적인 세포 사멸이 나타남을 보여주었다. Cas9 엔도뉴클레아아제의 표적 외 효과는 DNA 단일가닥 절단을 유도하기 위해 Cas9-nickase를 사용하고, PARP 억제제(PARP inhibitor; PARPi)로 그 복구를 차단함으로써 예방하였다. 재조합 Cas9-nickase 단백질과 다수의 합성 가이드 RNA를 PARPi와 함께 지질 나노입자를 통해 배양 세포, 생체 내 이종이식(xenografts), 환자 유래 암 오가노이드에 전달했을 때, 기능성 BRCA2 유전자가 존재하더라도 암세포는 유도된 DNA 손상을 견딜 수 없었다. 이러한 접근법은 검증된 안전성을 바탕으로 PARPi의 사용을 확장할 잠재력이 있으며, 개인화된 유전체 기반 항암치료를 위한 강력한 도구가 될 수 있다. 중요성: CRISPR/Cas9-nickase로 암 특이적 변이를 표적화하면 DNA 복구 경로 억제제와의 병용 하에 암 특이적인 세포 사멸을 유도하며, 광범위한 암을 치료하기 위한 CRISPR 암치료의 잠재력을 보여준다.

표 S3는 CRISPR/sgRNA의 표적 서열에 관한 정보를 서술하며, 여기에는 서열, 유전체 좌표, 그리고 예측되는 오프타깃의 개수가 포함된다.

초록DNA 손상을 유도함으로써 암세포 사멸을 유발하는 것이 방사선치료의 주요 목적이나, 정상세포 또한 손상을 받는다. 본 연구에서 우리는 Cas9 엔도뉴클레아제를 이용하여 합성 가이드 RNA 4종만을 전달하더라도 DNA 이중가닥 절단을 동시에 효율적으로 유도하여, 세포 유형 특이적인 방식으로 효율적인 세포 사멸을 일으킬 수 있음을 보여주었다. Cas9 엔도뉴클레아제의 오프타깃 효과는 DNA 단일가닥 절단을 유도하기 위해 Cas9-니카아제를 사용하고, PARP 억제제(PARP inhibitors, PARPi)로 이들 절단의 복구를 차단함으로써 예방하였다. 재조합 Cas9-니카아제 단백질과 다수의 합성 가이드 RNA를 PARPi와 함께 지질 나노입자를 통해 배양세포, in vivo 이종이식(xenograft), 및 환자 유래 암 오르가노이드에 전달했을 때, 기능적인 BRCA2 유전자가 존재하더라도 암세포는 유도된 DNA 손상을 견딜 수 없었다. 이러한 접근은 검증된 안전성을 바탕으로 PARPi의 사용을 확장할 잠재력을 가지며, 개인맞춤형 유전체 기반 항암치료를 위한 잠재적으로 강력한 도구가 될 수 있다.의의:<p>CRISPR/Cas9-니카아제로 암 특이적 변이를 표적화하면 DNA 복구 경로 억제제와의 병용 하에 암 특이적 세포 사멸이 유도되며, 광범위한 암종에 적용 가능한 CRISPR 암 치료의 잠재력을 보여준다.</p>