표적검증 / 기전연구 / 효능평가로 이어지는 운동의학융합연구 1차년도> TLR4 활성화에 의한 근감소증 발생기전 연구 - 근감소성 비만에 의한 내독소 증가 및 이에 대한 운동의 억제효과 관찰 - 급성 근육손상에서 TLR4/MD2 활성화 기전 검색 - Irisin에 의한 TLR4/MD2 활성화 억제 및 급성 근육손상 억제효과 관찰 - 2차년도 연구를 위한 FNDC5 KO 마우스 모델 구축 - 3차년도 연구를 위한 노화 마우스 모델 구축 2차년도> FNDC5 결핍 마우스를 활용한 장-근육-지방조직 염증 조절 기전연구 - FNDC5 KO 마우스를 이용한 irisin의 근육 항상성 제어 연구 - 3D 세포배양 co-culture 모델에서 근육-지방세포 상호작용 연구 - 유전체 정보 분석을 통한 irisin-TLR4-근감소증 상관관계 분석 3차년도> 재조합 irisin 투여에 의한 근감소증 치료효과 연구 - WT, FNDC5 KO 마우스에 재조합 irisin 투여 후 근감소증 개선효과 검증 - 노화 마우스 모델에 재조합 irisin 투여 후 근감소증 개선효과 검증 - Connectivity map을 활용한 근감소증 제어물질 탐색 시스템 구축 <핵심추진방법> - 근감소증 동물모델: 20주간의 고지방식이에 의한 근감소성 비만모델, 24개월령 마우스를 이용한 노화 근감소증 동물모델, 그리고 cardiotoxin의 근육주사를 통한 급성 근육손상 마우스모델을 사용하 여 TLR/MD2 활성화 측정과 irisin 효능평가 - 근육량 및 근육기능 평가를 위한 실험체계: 신진과제 수행을 통해 확립한 treadmill exercise protocol을 활용하여 지구력을 평가하고 grip strength test를 통해 악력평가. 조직염색을 통해 근육 줄기세포(Pax7+ satellite cell), 근섬유 발달(단일근섬유 면적 측정, laminin/MHC-I/MHC-II 면역염 색), 근감소증 지표(atrogene array), 단백질합성률(SUnSET법-비동위원소 puromycin을 이용한 in vivo 측정법), 단백질분해율(ubiquitin-proteasome), 신호전달경로(Akt, S6K, mTOR, IGF1, FoxO 등) 측정 - 장내 항상성 분석: 장투과성(FITC-dextran 경구투여 후 혈액 중 FITC 정량), 세포장벽(ZO-1, occludin), 혈중 내독소 측정. 장내 미생물 분석 - Primary myoblast culture system: 기존 연구를 통해 수립된 collagenase-trypsin 방법으로 근육조 직에서 전구세포를 분리 후, 1% horse serum을 5일간 처리하여 분화 유도. Myoblast에 cardiotoxin 처리를 통해 근육의 손상 및 재생에 대한 irisin-TLR4 기전에 대해 연구 - 3D co-culture system 구축: Hydrogel을 활용하여 24 well 하층에는 myoblast, 상층에는 adipocyte를 배양하여 조직 간 상호작용 관찰 - 세포 대사기능 분석: 근감소증과 밀접한 관련이 있는 자가포식작용과 미토콘드리아 기능 등의 세포 대사기능 분석은 본 연구실과 전남대학교 약학대학에 구비된 Seahorse bioanalyzer와 Lionheart FX 등의 고가장비를 활용 - 생물정보학적 분석: 본 연구실에서 보유한 분석법을 활용. Gene Expression Omnibus에서 근감소 증 환자 dataset을 3개 이상 추출하여 공통적으로 상향·하향조절 유전자를 선택 후 HumanNet와 MCODE 알고리즘을 활용해 Cytoscape 기반 네트워크 구축. WT과 FNDC5 결핍 마우스의 근육조직 도 동일하게 분석하여 통합된 기능적 네트워크 지도 작성. 구축한 유전자 발현 패턴을 Connectivity Map에 입력하여 irisin의 작용과 유사한 유전자변화를 유도하는 bioactive small molecule 발굴