최종 목표: EGFR Wild-type 및 변이 단백질을 과발현하는 비소세포폐암의 표적 치료제로 항체-사이토카인 융합단백질을 개발함으로써, 전 세계적으로 발병률과 사망률이 높은 폐암 치료에 대한 미충족 의료 수요를 충족시키고, 폐암 환자의 생존율과 삶의 질을 향상시키고자 함. [1차년도 연구목표] Cetuximab-setaferon 융합단백질의 효능 및 ...

[1차년도 연구목표] Cetuximab-setaferon 융합단백질의 효능 및 기전연구 ■ Cetuximab-setaferon 융합단백질의 직접 항암효과 및 기전 연구 ∙ Cell viability assay를 통한 cetuximab-setaferon 암세포 사멸 활성 검증 - 폐암 세포주 별 EGFR 발현 및 변이여부 확인 - Cell viability assay (WST)를 통해 cetuximab-setaferon 융합단백질의 직접 항암효과 확인 ∙ Cetuximab-setaferon 융합단백질에 의한 세포사멸 신호전달경로 연구 - Apoptosis 관련 단백질 변화 확인: TNF-alpha, TRAIL, Fas, Caspase 3, cleavage-caspase 3, cleavage-caspase 9, c-FLIP 등의 단백질 발현변화 확인 - EGFR 신호전달 경로 차단에 따른 세포사멸 확인, ∙ 신생혈관 억제 효과 확인 ∙ 폐암세포주에서 ADCC 유도 효과 확인 - NK92mi-CD16과 폐암세포주를 단시간 incubation하여, LDH 방출을 통한 ADCC 유도효과 확인 - NK92mi-CD16과 폐암세포주를 장시간 incubation하여, ADCC 유도에 의한 cytoxicity 확인 및 cytokine 분석 ■ Cetuximab-setaferon 융합단백질의 immune modulation을 통한 간접 항암효과 및 기전 연구 ∙ 폐암세포주와 PBMC co-culture를 통한 항암활성 및 cytokine 분석 - Primary PBMC와 폐암세포주의 co-culture를 통해 면역세포 매개 암세포 간접사멸 효과 확인 및 cytokine 분석 ∙ PBMC에서 cetuximab-setaferon 융합단백질에 의한 NK세포의 cytotoxicity 유도 기전 확인 - NK세포의 cytokine, perforin, granzyme 분비 변화 확인 - NK세포의 CD107a, CD69, Nkp30,44,46 등의 활성 마커 변화 확인 - NK세포의 PD-1, TIGIT 등의 면역관문단백질 발현 변화 확인 ∙ Human whole PBMC에서 cetuximab-setaferon 융합단백질 처리에 따른 T cell 활성 변화 연구 - 기존 연구에서 IFN-β에 의하여 monocyte, dendritic cell에서 CD80/CD86 발현 증가가 확인됨에 따라, cetuximab-setaferon 융합단백질에 의한 PBMC에서 CD80/60 발현 변화 확인 - T 세포와 dendritic cell 혹은 Treg cell과 T cell의 co-culture을 통해 cetuximab-setaferon 융합단백질 처리에 의한 T cell 활성 변화를 확인함으로써 적응면역계의 활성화에 의한 항암효과의 가능성 및 면역항암제와의 상승효과 가능성 제시 - 또한 cetuximab-setaferon 융합단백질 처리 시, cancer 세포주에서 CD80/60 발현변화를 확인함으로써 현재 중요한 항암치료제로 자리 잡은 면역항암제와의 상승효과 가능성을 확인함 ■ Syngeneic mouse 질환모델 구축을 위한 stable cell line 확보 ∙ Mouse의 syngeneic 질환 모델 구축을 위한 human EGFR을 안정적으로 과발현하는 stable cell line 구축 [2차년도 연구목표] Cetuximab-setaferon 융합단백질 in vivo 효능 연구 ■ Xenograft model을 이용한 cetuximab-setaferon 융합단백질의 직접항암효과 확인 ∙ Human NK세포 주입 폐암 xenograft model을 구축하고, 이를 통해 ADCC 매개 항암효과 확인 ■ Syngeneic mouse 질환모델에서의 항암 효과 확인 ∙ Human IFN Rc (IFNAR1/2를)를 발현하는 knock-in mouse를 활용해 syngeneic mouse 질환모델 구축 ∙ 면역체계가 보존되어 있는 syngeneic mouse질환모델에서 cetuximab-setaferon 융합단백질 항암효과 확인 ■ Single cell RNA seq을 통한 cetuximab-setaferon 융합단백질의 immune modulation 효과 확인 ∙ PBMC를 구성하는 면역세포군을 분리하여 cetuximab-setaferon 융합단백질 처리 후 populaiton 변화 확인 ∙ PBMC population 별 융합단백질 처리 후 single cell RNA seq를 통해 transcriptome 분석 → 1차년도 연구와 2차년도 PBMC RNA seq 결과를 바탕으로 immune modulation을 통한 간접적 항암기전 가설 확립 [3차년도 연구목표] Cetuximab-setaferon 융합단백질 in vivo/Ex vivo 기전 검증

1. EAE 동물모델에서 인터페론-β 치료 반응성에 따른 염증 상태/ 면역학적 반응 차이 규명 - 인터페론-β 치료에 따른 반응군과 미반응군을 각각 최소 5마리씩 확보함 - 인터페론-β 반응성에 영향을 미치는 병태생리적 인자 도출 2. EAE 면역세포에서 인터페론-β 신호전달 경로를 Ex vivo에서 확인 - EAE 질환모델에서 분리한 Peritoneal macrophage, bone marrow macrophage, splenocyte 세포에서 인터페론-β 처리 전후 신호전달 변화를 확인함으로써 각 세포의 인터페론-β 신호전달 체계를 확인함 3. 병태생리적 인자가 인터페론-β 신호전달경로에 미치는 영향을 확인하여 염증상태가 인터페론-β의 신호전달 기전에 미치는 영향을 확인함 - EAE 질환모델에서 분리한 Peritoneal macrophage, bone marrow macrophage, splenocyte 세포에서 염증 질환의 병태생리적 인자와 함께 인터페론-β를 처리 시 인터페론-β 신호전달 경로 변화 및 유전자 발현의 변화를 확인함 -인터페론-β 치료에 따른 반응군과 미반응군 EAE 질환모델에서 Peritoneal macrophage, bone marrow macrophage, splenocyte를 각각 분리하여 인터페론 -β 신호전달 전달 기전 차이를 확인하여 염증상태가 인터페론-β의 신호전달 기전에 미치는 영향을 확인함

본 과제는 특정 암세포를 표적으로 하는 항체와 면역 반응을 조절하는 인터페론-베타를 결합한 새로운 형태의 항암 융합 단백질 약물을 개발하고 최적화하는 연구임. 이 융합 단백질은 암세포에 선택적으로 작용하여 기존 항암제의 부작용을 줄이고 치료 효과를 높이는 것을 목표로 함. 연구 목표는 항-HER2 항체-인터페론-베타 변이체 융합단백질 후보물질의 효능 및 최적화 연구를 통해 최종 후보물질의 세포주를 구축하고, 최적화된 생산 공정을 개발하여 전임상 시료를 제작하며 전임상 시험을 완료하는 데 있음. 핵심 연구 내용은 융합 단백질의 유전자 construct 제작 및 in vitro 효능/MOA 검증 모델 구축을 통한 후보물질 평가, Candidate 세포주 은행 구축, 물리 화학적 특성 분석 및 조직교차반응성 시험, 정량-ELISA 개발, 전임상 시료 제작 기준 및 시험법 확립, 생산공정 확립을 포함함. 최종적으로 전임상 시료 생산 및 전임상 시험 완료 후 IND 승인신청을 목표로 함. 기대 효과는 신약개발 분야 전문가 양성과 최적화된 단백질 의약품 개발 플랫폼 구축을 통한 경제적 이득 및 치료비 절감임. 또한 신규 항암 융합단백질 개발로 항암제 수입대체 및 수출 증대에 크게 기여할 것으로 전망됨.