1. 전정기능 손상 동물 모델 확립 및 측정 플랫폼 개발 1) 전정기능 손상 모델 확립 - Capillary microinjection needle을 활용한 일측 혹은 양측 난형낭(utricle)에 외림프누공 형성을 통해 제작함. - 누공 형성 후 이독성 약제(cisplatin, gentamicin 등)를 투여하여 정량적인 전정기능 제거(ablation) 시행함. 2) 전정기능 손상 동물 모델의 기능적 표현형 분석 - 자세 정립 비율 및 이상 패턴 분석 - 안진 분석: 안구 운동 axis별 분석. 암시야 하에서 1000 frame 정밀 카메라 시스템 할용. - 전정-안반사(VOR) 분석: 반고리관 axis 별 분석. 전용 개체 회전 장비 및 1000 frame 카메라 활용. - Rheotaxis: 정상 반응 비율 및 deviation 각도 비교 분석. 전용 장비 및 EthoVision system 활용. - 행동 분석: 유영 거리, 속도, 패턴 분석. EthoVision system 활용 2. 말초 전정신경핵 및 전정 연관 뇌가소성 및 신경망 재조직에 대한 고찰 1) 실험군 구성 - 기능 제거(ablation) 범위 : 우측, 좌측, 양측 전정 손상군, 정상군 - 전정 기능 Ablation 시기 : embryo (5dpf), larva (15dpf) - 전정 기능Ablation 후 시각 자극 : 시각 자극 제공군, 시각 자극 박탈군 2) in vivo calcium channel imaging - 실험 개체는 보유 중인 Tg(5uas:GCaMP)를 사용 예정. - 기본적으로는 보유 중인 spinning confocal microscope을 사용 예정임. 말초 전정신경핵에 대해서는 spinning confocal microscope만으로 충분하지만, 뇌 활성도 분석을 위해서는 연구 효율성을 증가시키기 위해 넓은 범위의 live imaging을 구현할 수 있는 light sheet microscope을 사용 할 수 있음. 이에 대해서는 고려대학교 자연계캠퍼스 내 한국기초과학지원연구원과 장비 사용 계획을 논의하였음. - 생리적 자극이 가해지는 중 live imaging 을 위해 특수 제작된 rotating stage를 사용 예정임. 기본적으로 sine wave 형태의 가속도를 바탕으로 하는 oscillating 자극을 zebrafish를 1.5% agarose에 수직으로 embedding 한 상태에서 제공 예정임. Rotating stage 제작은 프랑스 파리 Sorbonne 대학의 Bormuth 교수가 고안한 방식을 바탕으로 구현 혹은 해당 장비를 구입 예정이며, per rotary 혹은 post rotary stimulation 중 live imaging 예정임. - 얻은 영상은 적절한 filtering을 통한 artifact 제거 후 Z-Brain 혹은 Zebrafish Brain Browser (ZBB)에 registration하여 관심 영역의 Fluorescence response를 regression 및 cluster analysis를 통해 계산 예정임. 3) 분석 목표 ROI - 말초 전정신경핵: Tangential vestibular nucleus, Medial vestibular nucleus - 중추 전정신경계: Rhombomeres 5-7, Medial octavolateralis nucleus, Cerebellum, Thalamus - 시각신경계: Optic tectum, nMedial longitudinal fascicle 4) 측정 중 생리적 자극 (아래 자극을 순차적으로 인가 후 반응 측정 예정) 전정 자극: Sinusoidal oscillating rotation을 전용 stage를 통해 제공 시각 자극: 4종류 LED(Thorlabs M365L2, M420L3, M470L3, and M590L3)를 stage에 제공 청각 자극: 140dB white noise를 monitor speaker를 통해 stage에 제공 5) 측정시점: ablation 후 3일, 15일, 30일 3. 말초 전정신영 축삭(axon) 및 수초(myelin)의 손상/재생 분석 -실험군 구성: 정상군, 일측성 전정 손상군 -방법: 기보유한 axon 및 myelin을 표시하는 transgenic line을 활용한 군별 손상 및 재생 범위 분석 -관찰 시기: 손상 후 3일, 30일. 유생기(larval period) 손상 개체에 대해서만 측정