전사 활성화인자 ToxT는 콜레라균(Vibrio cholerae)의 독성(virulence) 조절에 핵심적인 조절자로서, 콜레라 독소(cholera toxin, CT)와 독소-동조(토크린코레귤레이티드) 필러스(toxin co-regulated pilus, TCP)의 발현을 조절한다. toxT의 조절과 기능에 대한 통찰은 주로 toxT 발현이 강건한 고전적(biotype) 균주인 O395에 대한 연구에서 비롯되어 왔다. 그러나 toxT 발현은 V. cholerae의 균주 전반에서 완전히 일관되지는 않는다. 본 연구에서 우리는 균주 간, 특히 엘 토르(El Tor) 생물형에서, toxT의 전사와 단백질 생산이 유의미하게 다르며 이는 대립유전자(allele)에 의존적인 조절 제약에 기인함을 보인다. qRT-PCR과 웨스턴 블롯팅을 통해, 우리는 대체 toxT 대립유전자가 엘 토르 생물형 균주들에서 서로 다른 전사 활성화인자 기능을 부여함을 입증하였다. 특히, 팬데믹 엘 토르 균주인 IB5230은 37°C에서도 toxT 및 독성 유전자 발현이 증가되어 있어, 병원성 증대를 위한 잠재적 적응 가능성을 시사한다. 우리의 결과는 toxT의 자기조절(autoregulation) 피드백이 이전에 알려진 것보다 더 중요한 역할을 독성 유전자 활성화에서 수행한다는 점을 제안한다. 본 연구는 toxT 조절에 대해 기존에 인지되지 않았던 복잡성이 있음을 강조하며, 유행 중이거나 새롭게 출현하는 V. cholerae 균주에서 독성 조절 기작을 재평가할 필요성을 부각한다. 균주 특이적 차이를 이해하는 것은 콜레라 병인(pathogenesis)에 대한 모형을 정교화하는 데 필수적이다. 저자 요약(Author Summary) 콜레라는 콜레라균(Vibrio cholerae)이라는 세균에 의해 유발되는 중증 설사 질환으로, 전 세계 보건에 대한 주요 위협으로 계속되고 있다. V. cholerae가 질병을 일으키는 능력은 전사 활성화인자인 ToxT에 의해 조절되는 두 가지 핵심 독성 인자—콜레라 독소(cholera toxin, CT)와 독소-동조 필러스(toxin-coregulated pilus, TCP)—의 발현에 달려 있다. ToxT 조절에 대한 우리의 이해의 상당 부분은 고전적 생물형 균주에 기반하고 있으나, 최근 대부분의 콜레라 유행은 엘 토르(El Tor) 생물형 균주에 의해 주도되었다. 본 연구에서 우리는 toxT 발현과 독성 유전자를 활성화하는 능력이 V. cholerae 균주 전반에서 현저하게 달라지며, 이는 특정 toxT 대립유전자와 유전적 배경 모두에 의존함을 보여준다. 서로 다른 toxT 대립유전자를 발현하도록 조작한 동일 유전적(isogenic) 균주를 사용하여, 특정 대립유전자는 일부 엘 토르 균주에서는 전사적으로 침묵하는 반면, 다른 대립유전자는 활성화되어 있음을 확인하였다. 다만 발현되었을 때에는 기능적 능력이 유사하다는 점에서 공통적이다. 특히, 아이티(하이티) 콜레라 유행과 연관된 고독성(hypervirulent) 균주는 사람 체온에서조차 높은 toxT 발현을 유지하여, 병원성 증대를 위한 적응 기작 가능성을 시사한다. 우리의 결과는 V. cholerae에서의 독성 조절이 이전에 인지되었던 것보다 더 가변적일 수 있음을 제안하며, toxT 발현에서 나타나는 균주 및 대립유전자 특이적 차이를 강조한다. 독성 유전자 조절에서의 이러한 균주 및 대립유전자 특이적 차이를 이해하는 것은 콜레라 병인에 대한 모형을 개선하는 데 중요하며, 이 진화하는 병원체에 대한 보다 효과적인 중재와 백신 개발에 정보를 제공할 수 있을 것이다.

본 연구에서 평가한 대립유전자는 LB 배지에서의 흔들어 배양(shake culture)을 포함하는 단순한 배양 조건 하에서 El Tor 생물형 균주에서 독성(virulence) 유전자의 발현을 가능하게 하였으며, 이는 독성 유전자 발현의 조절이 이전에 생각되었던 것보다 더 복잡할 수 있고, ToxR 조절원(ToxR regulon)에 의한 ToxT 생성 이외에 추가 요인이 관여할 수 있음을 시사한다.

기존의 PCR에 사용하는 복제본과 동일하게 설정하였다. LAMP 분석은 β-락타마제 유전자 4종을 검출하였으며, 민감도는 DNA를 정제한 템플릿을 사용한 경우와 DNA-spiked 소변, 객담 및 혈액 검체에서 유사하였다. 반면, PCR의 민감도는 DNA-spiked 임상 검체에서 1~100배 낮았다. 따라서 LAMP 분석은 β-락타마제 4종을 검출하는 적절한 도구임이 입증되었다.

-139F 대립유전자는 콜레라 백신의 우수한 후보들이다.

전사 활성화인자 ToxT는 콜레라균(Vibrio cholerae)의 독성(virulence) 조절에 핵심적인 조절자로서, 콜레라 독소(cholera toxin, CT)와 독소-동조(토크린코레귤레이티드) 필러스(toxin co-regulated pilus, TCP)의 발현을 조절한다. toxT의 조절과 기능에 대한 통찰은 주로 toxT 발현이 강건한 고전적(biotype) 균주인 O395에 대한 연구에서 비롯되어 왔다. 그러나 toxT 발현은 V. cholerae의 균주 전반에서 완전히 일관되지는 않는다. 본 연구에서 우리는 균주 간, 특히 엘 토르(El Tor) 생물형에서, toxT의 전사와 단백질 생산이 유의미하게 다르며 이는 대립유전자(allele)에 의존적인 조절 제약에 기인함을 보인다. qRT-PCR과 웨스턴 블롯팅을 통해, 우리는 대체 toxT 대립유전자가 엘 토르 생물형 균주들에서 서로 다른 전사 활성화인자 기능을 부여함을 입증하였다. 특히, 팬데믹 엘 토르 균주인 IB5230은 37°C에서도 toxT 및 독성 유전자 발현이 증가되어 있어, 병원성 증대를 위한 잠재적 적응 가능성을 시사한다. 우리의 결과는 toxT의 자기조절(autoregulation) 피드백이 이전에 알려진 것보다 더 중요한 역할을 독성 유전자 활성화에서 수행한다는 점을 제안한다. 본 연구는 toxT 조절에 대해 기존에 인지되지 않았던 복잡성이 있음을 강조하며, 유행 중이거나 새롭게 출현하는 V. cholerae 균주에서 독성 조절 기작을 재평가할 필요성을 부각한다. 균주 특이적 차이를 이해하는 것은 콜레라 병인(pathogenesis)에 대한 모형을 정교화하는 데 필수적이다. 저자 요약(Author Summary) 콜레라는 콜레라균(Vibrio cholerae)이라는 세균에 의해 유발되는 중증 설사 질환으로, 전 세계 보건에 대한 주요 위협으로 계속되고 있다. V. cholerae가 질병을 일으키는 능력은 전사 활성화인자인 ToxT에 의해 조절되는 두 가지 핵심 독성 인자—콜레라 독소(cholera toxin, CT)와 독소-동조 필러스(toxin-coregulated pilus, TCP)—의 발현에 달려 있다. ToxT 조절에 대한 우리의 이해의 상당 부분은 고전적 생물형 균주에 기반하고 있으나, 최근 대부분의 콜레라 유행은 엘 토르(El Tor) 생물형 균주에 의해 주도되었다. 본 연구에서 우리는 toxT 발현과 독성 유전자를 활성화하는 능력이 V. cholerae 균주 전반에서 현저하게 달라지며, 이는 특정 toxT 대립유전자와 유전적 배경 모두에 의존함을 보여준다. 서로 다른 toxT 대립유전자를 발현하도록 조작한 동일 유전적(isogenic) 균주를 사용하여, 특정 대립유전자는 일부 엘 토르 균주에서는 전사적으로 침묵하는 반면, 다른 대립유전자는 활성화되어 있음을 확인하였다. 다만 발현되었을 때에는 기능적 능력이 유사하다는 점에서 공통적이다. 특히, 아이티(하이티) 콜레라 유행과 연관된 고독성(hypervirulent) 균주는 사람 체온에서조차 높은 toxT 발현을 유지하여, 병원성 증대를 위한 적응 기작 가능성을 시사한다. 우리의 결과는 V. cholerae에서의 독성 조절이 이전에 인지되었던 것보다 더 가변적일 수 있음을 제안하며, toxT 발현에서 나타나는 균주 및 대립유전자 특이적 차이를 강조한다. 독성 유전자 조절에서의 이러한 균주 및 대립유전자 특이적 차이를 이해하는 것은 콜레라 병인에 대한 모형을 개선하는 데 중요하며, 이 진화하는 병원체에 대한 보다 효과적인 중재와 백신 개발에 정보를 제공할 수 있을 것이다.

본 연구에서 평가한 대립유전자는 LB 배지에서의 흔들어 배양(shake culture)을 포함하는 단순한 배양 조건 하에서 El Tor 생물형 균주에서 독성(virulence) 유전자의 발현을 가능하게 하였으며, 이는 독성 유전자 발현의 조절이 이전에 생각되었던 것보다 더 복잡할 수 있고, ToxR 조절원(ToxR regulon)에 의한 ToxT 생성 이외에 추가 요인이 관여할 수 있음을 시사한다.

기존의 PCR에 사용하는 복제본과 동일하게 설정하였다. LAMP 분석은 β-락타마제 유전자 4종을 검출하였으며, 민감도는 DNA를 정제한 템플릿을 사용한 경우와 DNA-spiked 소변, 객담 및 혈액 검체에서 유사하였다. 반면, PCR의 민감도는 DNA-spiked 임상 검체에서 1~100배 낮았다. 따라서 LAMP 분석은 β-락타마제 4종을 검출하는 적절한 도구임이 입증되었다.

-139F 대립유전자는 콜레라 백신의 우수한 후보들이다.

.

콜레라의 원인균인 Vibrio cholerae는 수생 환경에 자생하는 세균이며, 중대한 공중보건 위협이다. V. cholerae 혈청군 O1은 이전의 두 차례 콜레라 대유행을 일으킨 원인으로, 6번째 대유행에서는 고전적(classical) 및 El Tor 생물형이 우점하였고, 현재의 7번째 대유행에서는 El Tor 생물형이 우점한다. 콜레라 연구자들은 새롭게 출현하거나 다시 출현하는 병원성 클론이 새로운 혈청군의 조합뿐 아니라 표현형 및 유전형 특성의 조합을 함께 지닌 채 지속적으로 나타나는 문제에 끊임없이 직면한다. 이러한 유전형과 표현형의 변화는 질병 통제를 저해해 왔다. 본 연구에서는 지난 98년 동안 다양한 출처와 지리적 위치에서 분리된 V. cholerae 23개 균주의 완전한 게놈 서열을 비교하여, 유전적 다양성의 생성과 새로운 병원성 클론의 기원 및 이를 지배하는 진화 메커니즘을 규명하고자 하였다. 게놈 기반 계통수는 V. cholerae의 12개의 뚜렷한 계통성(phyletic) 계통을 보여주었으며, 그중 하나인 V. cholerae 핵심 게놈(core genome, CG)은 고전적 O1 생물형과 El Tor 생물형을 모두 포함한다. 7번째 대유행 클론 7개는 거의 동일한 유전자 구성, 즉 동일한 게놈 골격(genome backbone)을 공유한다. 6번째에서 7번째 대유행으로의 전이는, 동일한 O1 혈청군에 속하면서도 CG 계통군 내에서 상당히 다른 계통성 계통에 속하는 병원성 클론 사이의 ‘shift’로 여기서 정의된다. 반대로, 현재 7번째 대유행 기간 동안 클론들 사이의 전이는, 측방 유전자 이동(laterally transferred)으로 유입되는 게놈 섬(genomic islands)의 조성 차이에 의해 주로 구별되어, 고전적 생물형의 콜레라 독소를 생성하는 V. cholerae 혈청군 O139 및 V. cholerae O1 El Tor 혼합(hybrid) 클론을 예로 들 수 있는 변이체의 출현을 초래하는 ‘drift’로 특징지을 수 있다. 본 연구에서 제시한 포괄적 비교유전체학(comparative genomics)에 근거하여, V. cholerae는 측방 유전자 이동을 통한 광범위한 유전적 재조합을 겪으며, 따라서 혈청군이 아니라 유전체의 조합(genome assortment)이 병원성 V. cholerae 클론을 정의하는 데 사용되어야 한다고 결론내린다.

-디머. NtrCTB와 NtrCTB-디머는 모두 세균 세포 내에 잔존하였으며, 세균 세포 내 NtrCTB-디머의 60%가 용해성 형태로 유지되었다. 보다 향상된 OCV를 개발하기 위해, 이러한 균주가 동물 모델에서 CTB에 대한 면역 반응을 유도하는지 여부를 평가해 볼 수 있다.

폐렴구균 결합백신(pneumococcal conjugate vaccines, PCV7 및 PCV13) 도입 이후 Streptococcus pneumoniae에 의한 침습성 질환의 보고는 감소해 왔다. 그러나 백신이 다루지 않는 S. pneumoniae 침습성 질환의 발생률은 소아와 성인에서 증가하여 전 세계적인 공중보건 문제가 되고 있다. 이전에 우리는 PCV13 혈청형 특이적 분석법을 위해 루프매개 등온증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 방법을 확립하였다. 본 연구에서는 LAMP 방법을 이용하여 23가 폐렴구균 다당백신(23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine, PPSV23)에서 혈청형을 검출하는 신속하고 단순하며 비용효과적인 분석법을 개발하였다. 본 연구에서는 S. pneumoniae의 혈청형 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F, 33F에 대한 LAMP 프라이머 세트를 개발하였다. LAMP 분석법의 반응성, 특이성 및 민감도는 기존 PCR 분석법과 비교하여 결정하였다. 침습성 폐렴구균 질환 환자에서의 임상 적용 가능성은 세균 유전체 DNA를 첨가한 혈액 시료를 사용하여 LAMP 분석법의 검출한계를 설정함으로써 검증하였다. 각 LAMP 분석법의 특이성은 폐렴구균 균주의 44개 혈청형을 이용하여 결정하였다. 민감도는 LAMP 분석법이 반응당 100 copies인 반면 PCR 분석법은 반응당 103~106 copies였다. DNA를 첨가한 혈액 시료를 사용하되 혈청형 22F를 표적하는 LAMP 분석법(반응당 103 copies)을 제외했을 때, LAMP 분석법의 검출한계는 주형으로 정제 DNA를 사용했을 때와 유사하게 반응당 102 copies였다. 이는 PCR 분석법에서의 반응당 103~>106 copies와 비교된다. 결론적으로, 여러 국가에서 사용하기 위한 PPSV23 표적 혈청형 검출용 신속하고 단순한 LAMP 기반 분석법을 개발하였다. 본 연구는 PPSV23 혈청형을 식별하기 위한 LAMP 기반 분석법에 대한 최초 보고이다. 감시 및 백신 효능 연구를 통해 본 분석법에 대한 추가 평가가 필요하다.

균주는 이러한 특성에 근거하여 분석될 수 있다. 추가적인 유전체 데이터의 축적은 보다 정밀한 유전체 기반 병원성 특성 분석 도구의 구축을 신속하게 할 것이다.