유전자 편집은 다양한 종류의 생물체에서 게놈 DNA에 대해 정밀한 수정을 가능하게 하여 분자생물학을 획기적으로 변화시켰다. 유전자 편집 기술은 특정 DNA 서열을 추가, 제거, 또는 변형할 수 있게 하며, 유전자 녹아웃, 치료 목적의 유전자 교정, 표적 유전 형질의 설계 등 다양한 응용 분야를 포함한다. 이러한 기술은 주로 두 가지 DNA 복구 기전에 의존한다. 즉, 정밀한 게놈 변화를 가능하게 하는 상동성 유도 복구(homology-directed repair, HDR)와, 종종 결실이나 프레임시프트 오류와 같은 돌연변이를 초래하는 비상동 말단 결합(non-homologous end joining, NHEJ)이 그것이다. 다양한 유전자 편집 플랫폼 가운데 CRISPR-Cas 시스템은 단순성, 저비용, 효율성에 기인하여 가장 널리 사용되는 체계로 부상해 왔다. 본 총설에서는 CRISPR-Cas 시스템에 특히 중점을 두면서 유전자 편집 기술의 발전 과정을 제시하고, 유전학, 생명공학, 농업, 의학에서의 확장되는 응용을 다룬다. 또한, 새롭게 부상하는 경향을 개괄하는 고도화된 유전자 편집 접근법에 대해서도 논의한다.

정상적인 감수분열기 이중가닥 절단(double-strand break, DSB) 수복 과정에서 대부분의 DSB는 엄격하게 조절된 5' 말단 절단(5' end resection)을 거치며, 그 결과 3' 단일가닥(single-stranded, ss) DNA 꼬리가 생성된다. 이러한 꼬리는 Rad51과 Dmc1 필라멘트로 조립되어 상동성 탐색과 가닥 교환을 촉진함으로써 재조합을 가능하게 한다. 그러나 대부분의 교차(crossover) 및 비교차(noncrossover) 과정과 관련하여, DSB에서 ssDNA의 3' 말단에서 국소적 DNA 합성이 발생하는지, 그리고 재조합 부위에서 DNA 중합효소가 관여하는지는 DNA 수준에서 명확하지 않았다. 이에 우리는 재조합 사건의 물리적 분석, 티미딘 유사체의 시간적 주입, 초해상도 현미경 영상화를 통해 Saccharomyces cerevisiae에서 재조합-연동 DNA 합성(meiotic recombination-coupled DNA synthesis, MRDS)을 조사하였다. 그 결과 DNA 중합효소 δ(DNA polymerase δ, Pol δ)가 end-primed 합성(end-primed synthesis) 활성에 의해 초기 D-loop를 연장하는 데 필요함을 확인하였다. 특히 Pol δ에 의해 매개되는 MRDS는 이중 홀리데이 접합(double Holliday junction) 및 비교차 형성 모두에 대해 침윤(invasion) 이후 단계들을 촉진한다. 우리는 MRDS가 end-primed 합성을 통해 displacement-loop/single-end 침윤 연장을 위해 요구되며, 선도 가닥(leading strand)과 상보 가닥(complementary strand) 사이의 정확한 염기 짝맞춤을 보장한다는 점을 추정하였다. 본 연구는 MRDS에서 Pol δ의 결정적 역할을 강조하며, 침윤 이후 단계에서 재조합의 강건한 조절 양상을 보여준다.

감수분열 재조합은 프로그램된 이중가닥 절단(DSB)에 의해 개시된다. Saccharomyces cerevisiae에서의 연구들은, 3' 단일가닥 DNA(ssDNA) 꼬리를 생성하도록 급속한 절제가 일어난 뒤에는 하나의 DSB 말단이 상동 파트너 염색분체에 결합하여 DNA 합성에 의해 신장되는 반면, 다른 말단은 자신의 자매 염색분체와 연관된 채로 남아 있음을 보여주었다. 그 다음에는 교차(crossover) 및 비교차(noncrossover)로 운명이 정해진 유형들로의 조절된 분화 이후, 두 번째 DSB 말단이 신장된 첫 번째 말단과의 가닥 상동(annealing)을 통해, 두 경로 모두에서 반응에 참여한다. 이러한 두 번째 말단의 포획(capture)은 Rad52에 의존하며, 이는 알려진 두 개의 ssDNA를 상동결합(anneal)할 수 있는 능력을 통해 이루어지는 것으로 추정된다. 여기서는 DNA 재조합에 대한 물리적 분석을 이용하여, 이 과정이 ssDNA 결합 단백질인 복제 단백질 A(RPA)와의 Rad52의 직접적 상호작용에 의존함을 입증한다. 또한 이러한 Rad52–RPA 공동 활성(joint activity)의 부재는, 감수분열 전기(전기 prophase)의 파키텐(pachytene) 단계 동안 교차 부위에서 상동 축(homolog axes)으로부터 생성되는 세포학적으로 두드러진 RPA 스파이크(spike)를 초래한다. 우리의 결과는 이 스파이크가, 전도(leading) DSB 말단의 치환으로 인한 것 또는 두 번째 DSB 말단의 어느 쪽이든, 파트너 상동체에 결합된 ssDNA와 결합하지 못해 생긴 파열된 염색분체의 DSB 말단을 나타낸다는 점을 시사한다. 이러한 결과들과 그 밖의 관찰들은, 감수분열 재조합에서의 Rad52–RPA의 역할과, 분열기(mitotic) DSB 수복 사이의 밀접한 대응성을 의미한다.

배경: 대장암(Colorectal cancer, CRC)은 가장 흔한 암의 한 유형이다. 이 질환은 유전자 돌연변이와 후성유전학적 변화로 인해 결장 상피세포가 결장 선암 세포로 전환되면서 발생하며, 이들 세포는 정상 세포와 비교하여 고유한 유전자 발현 양상을 보인다. 구체적으로 CRC 세포는 DNA 복구 또는 복제에 관여하는 유전자들의 발현 수준이 현저히 높으며, 이는 빠른 세포주기 진행으로 인해 누적되는 DNA 절단 손상에 기인한다. 목적: 본 연구는 CRC 세포에 대한 카페인의 생체 내(in vivo) 효과를 규명하고, CRC 치료에 널리 사용되는 topoisomerase I 억제제인 이리노테칸(irinotecan)에 대한 이들 세포의 민감도에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 방법: 두 가지 CRC 세포주인 HCT116과 HT29를 이리노테칸과 카페인으로 처리하였다. Western blot 분석을 통해 카페인/이리노테칸 처리 CRC 세포에서의 단백질 발현 수준을 평가하였다. 면역형광 염색은 단백질의 위치를 확인하고 DNA 절단을 측정했으며, 세포주기 진행 중 DNA 손상 유도 물질의 영향을 탐색하였다. 또한 유세포분석을 통해 세포 생존율을 측정하였다. 섬유(파이버) 분석은 S기 동안 DNA 손상 세포에서의 DNA 합성을 조사하였고, comet assay는 DNA 절단으로 인한 DNA 단편화를 평가하였다. 결과: 본 연구 결과, 이리노테칸과 카페인을 병용하면 CRC 세포 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 데 시너지 효과가 있음을 확인하였다. 이리노테칸 또는 카페인 단독 처리에 비해, 이리노테칸과 카페인을 병용한 처리는 RAD51을 DNA 절단 부위에서 치환(displacing)함으로써 DNA 손상을 더 효과적으로 유도하고 DNA 복구 진행을 억제하여 세포주기 정지를 유발하였다. 또한 이러한 병용은 DNA 단편화와 미토시스(mitotic) 카타스트로피를 포함한 더 심각한 효과도 나타냈다. 결론: 카페인은 CRC 세포의 생존율에 큰 영향을 주지 않으면서도 CRC 치료에 사용되는 기존 약물의 효과를 강화할 수 있을 가능성이 있다. 본 연구 결과는 카페인의 유익한 보조(adjuvant) 효과가 CRC에만 적용되는 것이 아니라 발달 단계가 다른 다양한 다른 암 유형에도 적용될 수 있음을 시사한다.

유전자 편집은 다양한 종류의 생물체에서 게놈 DNA에 대해 정밀한 수정을 가능하게 하여 분자생물학을 획기적으로 변화시켰다. 유전자 편집 기술은 특정 DNA 서열을 추가, 제거, 또는 변형할 수 있게 하며, 유전자 녹아웃, 치료 목적의 유전자 교정, 표적 유전 형질의 설계 등 다양한 응용 분야를 포함한다. 이러한 기술은 주로 두 가지 DNA 복구 기전에 의존한다. 즉, 정밀한 게놈 변화를 가능하게 하는 상동성 유도 복구(homology-directed repair, HDR)와, 종종 결실이나 프레임시프트 오류와 같은 돌연변이를 초래하는 비상동 말단 결합(non-homologous end joining, NHEJ)이 그것이다. 다양한 유전자 편집 플랫폼 가운데 CRISPR-Cas 시스템은 단순성, 저비용, 효율성에 기인하여 가장 널리 사용되는 체계로 부상해 왔다. 본 총설에서는 CRISPR-Cas 시스템에 특히 중점을 두면서 유전자 편집 기술의 발전 과정을 제시하고, 유전학, 생명공학, 농업, 의학에서의 확장되는 응용을 다룬다. 또한, 새롭게 부상하는 경향을 개괄하는 고도화된 유전자 편집 접근법에 대해서도 논의한다.

정상적인 감수분열기 이중가닥 절단(double-strand break, DSB) 수복 과정에서 대부분의 DSB는 엄격하게 조절된 5' 말단 절단(5' end resection)을 거치며, 그 결과 3' 단일가닥(single-stranded, ss) DNA 꼬리가 생성된다. 이러한 꼬리는 Rad51과 Dmc1 필라멘트로 조립되어 상동성 탐색과 가닥 교환을 촉진함으로써 재조합을 가능하게 한다. 그러나 대부분의 교차(crossover) 및 비교차(noncrossover) 과정과 관련하여, DSB에서 ssDNA의 3' 말단에서 국소적 DNA 합성이 발생하는지, 그리고 재조합 부위에서 DNA 중합효소가 관여하는지는 DNA 수준에서 명확하지 않았다. 이에 우리는 재조합 사건의 물리적 분석, 티미딘 유사체의 시간적 주입, 초해상도 현미경 영상화를 통해 Saccharomyces cerevisiae에서 재조합-연동 DNA 합성(meiotic recombination-coupled DNA synthesis, MRDS)을 조사하였다. 그 결과 DNA 중합효소 δ(DNA polymerase δ, Pol δ)가 end-primed 합성(end-primed synthesis) 활성에 의해 초기 D-loop를 연장하는 데 필요함을 확인하였다. 특히 Pol δ에 의해 매개되는 MRDS는 이중 홀리데이 접합(double Holliday junction) 및 비교차 형성 모두에 대해 침윤(invasion) 이후 단계들을 촉진한다. 우리는 MRDS가 end-primed 합성을 통해 displacement-loop/single-end 침윤 연장을 위해 요구되며, 선도 가닥(leading strand)과 상보 가닥(complementary strand) 사이의 정확한 염기 짝맞춤을 보장한다는 점을 추정하였다. 본 연구는 MRDS에서 Pol δ의 결정적 역할을 강조하며, 침윤 이후 단계에서 재조합의 강건한 조절 양상을 보여준다.

감수분열 재조합은 프로그램된 이중가닥 절단(DSB)에 의해 개시된다. Saccharomyces cerevisiae에서의 연구들은, 3' 단일가닥 DNA(ssDNA) 꼬리를 생성하도록 급속한 절제가 일어난 뒤에는 하나의 DSB 말단이 상동 파트너 염색분체에 결합하여 DNA 합성에 의해 신장되는 반면, 다른 말단은 자신의 자매 염색분체와 연관된 채로 남아 있음을 보여주었다. 그 다음에는 교차(crossover) 및 비교차(noncrossover)로 운명이 정해진 유형들로의 조절된 분화 이후, 두 번째 DSB 말단이 신장된 첫 번째 말단과의 가닥 상동(annealing)을 통해, 두 경로 모두에서 반응에 참여한다. 이러한 두 번째 말단의 포획(capture)은 Rad52에 의존하며, 이는 알려진 두 개의 ssDNA를 상동결합(anneal)할 수 있는 능력을 통해 이루어지는 것으로 추정된다. 여기서는 DNA 재조합에 대한 물리적 분석을 이용하여, 이 과정이 ssDNA 결합 단백질인 복제 단백질 A(RPA)와의 Rad52의 직접적 상호작용에 의존함을 입증한다. 또한 이러한 Rad52–RPA 공동 활성(joint activity)의 부재는, 감수분열 전기(전기 prophase)의 파키텐(pachytene) 단계 동안 교차 부위에서 상동 축(homolog axes)으로부터 생성되는 세포학적으로 두드러진 RPA 스파이크(spike)를 초래한다. 우리의 결과는 이 스파이크가, 전도(leading) DSB 말단의 치환으로 인한 것 또는 두 번째 DSB 말단의 어느 쪽이든, 파트너 상동체에 결합된 ssDNA와 결합하지 못해 생긴 파열된 염색분체의 DSB 말단을 나타낸다는 점을 시사한다. 이러한 결과들과 그 밖의 관찰들은, 감수분열 재조합에서의 Rad52–RPA의 역할과, 분열기(mitotic) DSB 수복 사이의 밀접한 대응성을 의미한다.

배경: 대장암(Colorectal cancer, CRC)은 가장 흔한 암의 한 유형이다. 이 질환은 유전자 돌연변이와 후성유전학적 변화로 인해 결장 상피세포가 결장 선암 세포로 전환되면서 발생하며, 이들 세포는 정상 세포와 비교하여 고유한 유전자 발현 양상을 보인다. 구체적으로 CRC 세포는 DNA 복구 또는 복제에 관여하는 유전자들의 발현 수준이 현저히 높으며, 이는 빠른 세포주기 진행으로 인해 누적되는 DNA 절단 손상에 기인한다. 목적: 본 연구는 CRC 세포에 대한 카페인의 생체 내(in vivo) 효과를 규명하고, CRC 치료에 널리 사용되는 topoisomerase I 억제제인 이리노테칸(irinotecan)에 대한 이들 세포의 민감도에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 방법: 두 가지 CRC 세포주인 HCT116과 HT29를 이리노테칸과 카페인으로 처리하였다. Western blot 분석을 통해 카페인/이리노테칸 처리 CRC 세포에서의 단백질 발현 수준을 평가하였다. 면역형광 염색은 단백질의 위치를 확인하고 DNA 절단을 측정했으며, 세포주기 진행 중 DNA 손상 유도 물질의 영향을 탐색하였다. 또한 유세포분석을 통해 세포 생존율을 측정하였다. 섬유(파이버) 분석은 S기 동안 DNA 손상 세포에서의 DNA 합성을 조사하였고, comet assay는 DNA 절단으로 인한 DNA 단편화를 평가하였다. 결과: 본 연구 결과, 이리노테칸과 카페인을 병용하면 CRC 세포 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 데 시너지 효과가 있음을 확인하였다. 이리노테칸 또는 카페인 단독 처리에 비해, 이리노테칸과 카페인을 병용한 처리는 RAD51을 DNA 절단 부위에서 치환(displacing)함으로써 DNA 손상을 더 효과적으로 유도하고 DNA 복구 진행을 억제하여 세포주기 정지를 유발하였다. 또한 이러한 병용은 DNA 단편화와 미토시스(mitotic) 카타스트로피를 포함한 더 심각한 효과도 나타냈다. 결론: 카페인은 CRC 세포의 생존율에 큰 영향을 주지 않으면서도 CRC 치료에 사용되는 기존 약물의 효과를 강화할 수 있을 가능성이 있다. 본 연구 결과는 카페인의 유익한 보조(adjuvant) 효과가 CRC에만 적용되는 것이 아니라 발달 단계가 다른 다양한 다른 암 유형에도 적용될 수 있음을 시사한다.

배경: 코헤신은 염색체 관련 SMC-클레이신(SMC-kleisin) 복합체로, 자매염색분체 응집, 재조합 및 유사분열과 감수분열 동안 대부분의 염색체 과정들을 매개한다. 그러나 감수분열 특이적 코헤신 복합체가 유사분열 염색체에서 기능적으로 활성인지 여부는 아직 불분명하다. 결과: 고해상도 3차원 구조화 조명 현미경(3D-SIM)과 기능 분석을 통해, 감수분열 특이적 코헤신 구성요소인 α-클레이신 REC8 및 STAG3와 연관된 여러 생물학적 과정, 그리고 배아줄기세포(ESCs)의 세포주기 동안 감수분열 코헤신의 기능 상실이 구별되게 나타나는 현상을 보고한다. 첫째, REC8과의 상호작용을 통해 STAG3가 REC8의 핵 내 효율적 위치결정에 필요함을 보여준다. REC8-STAG3를 포함하는 코헤신은 염색체의 위상학적(topological) 성질을 조절하고 자매염색분체 응집을 유지한다. 둘째, REC8-코헤신은 ESC 염색체에서 유사분열 RAD21-코헤신과 함께 협동하여 자매염색분체 응집의 추가적 역할을 수행한다. REC8 및 RAD21의 공염색을 통한 SIM 영상은, 두 유형의 α-클레이신 소단위가 ESC 염색체를 따라 서로 다른 로딩 패턴을 보였음을 확인하였다. 셋째, REC8 또는 RAD21-코헤신의 노크다운은 조기 자매염색분체 분리를 더 높은 비율로 유도하고 DNA 복제 포크 진행을 지연시켜 증식 및 발달 결함을 유발할 뿐 아니라, 전기(前期, prophase) 이후부터 망막모세포단백질-응축소좀(condensin) 복합체의 과도한 로딩으로 인해 염색체 응축을 강화한다. 결론: 우리의 결과는 유사분열과 감수분열 코헤신 사이의 섬세한 균형이 ESC 특이적 염색체 조직과 유사분열 프로그램을 조절할 수 있음을 시사한다.

서로 관련된 두 단백질 복합체인 코헤신(cohesin)과 컨덴신(condensin)은 세포 분열 동안 유전체가 딸세포로 정확하게 분리되도록 하는 데 필수적인 역할을 수행한다. 그러나 배아줄기세포(embryonic stem cells)에서 코헤신과 컨덴신 간의 상호작용은 아직 명확하지 않으며, 또한 감수분열(meiosis) 특이적 코헤신 복합체의 구체적 기능 역시 밝혀지지 않았다. 코헤신은 아나페이즈(anaphase)에서의 분리를 전제로 복제된 자매 염색분체(sister chromatids) 간의 결속을 유지하는 반면, 컨덴신은 염색체를 분열기 특유의 고도로 조밀한 구조로 재구성하는 데 관여한다. 첫째, ChIP-seq 분석을 통해 코헤신(SMC3, RAD21, REC8)과 컨덴신(SMC4)이 서로 인접한 위치에서 DNA 결합 부위를 공유하며, 억제자(insulator) 단백질인 CTCF와 직접 상호작용함을 확인하였다. 둘째, siRNA로 조절한 SMC3의 결핍은 SMC4의 핵 내 축적을 초래하였다. 셋째, 배아줄기(ES) 세포는 감수분열의 케클레신( kleisin) 소단위인 REC8을 포함하는 코헤신 복합체를 독특하게 보유하고 있었다. RAD21의 억제(knockdown)는 SMC3-REC8 복합체의 비율을 증가시켰다. 본 연구 결과는 코헤신과 컨덴신이 염색체 조직(chromosomal organization)의 기능에 중요한 기여를 하며, 감수분열 코헤신은 ES 세포에서의 분열기(mitotic) 프로그램에 특이적으로 필요할 수 있음을 시사한다.

ER 스트레스에 대한 세포 적응 과정에서.