□ 1차 년도 □□ 치주인대줄기세포가 배양된 conditioned media (CM)의 secretome-soluble factor 분석 ● 2×105개의 치주인대줄기세포를 CM (serum‑free α-MEM)에 48시간 동안 배양함. ● 48시간 후 CM을 수집하여 1200 rpm, 5분 동안 원심분리를 진행하고 상층액을 취함. ● 다시 한번 상층액을 3000 rpm, 3분 동안 원심분리하여 새로운 CM 상층액을 수집함. ● Ultracel‑10 membrane (Millipore)을 이용하여 상층액을 ultrafiltering하여 농축시킴. ● Protein microarray를 실시하여 CM에 분비된 줄기세포 secretome-soluble factor를 프로파일링함 (세포가 없는 serum‑free α-MEM을 대조군으로 사용) □ 줄기세포 secretome의 extracellular vesicles (EVs) 분리 및 동정 ● 줄기세포 배양 48시간 후 상기의 방법으로 CM을 원심분리하여 상층액을 수집함. ● EVs isolation kit (Capturem™, TaKaRa)를 이용하여 제조사 제공 프로토콜에 따라 EVs 분리. ● 분리된 EVs는 단백질 정량을 실시하여 앞서 언급한 EVs의 exosome marker인 CD63, CD9, Alix의 발현을 Western blotting으로 검증함. ● 전자현미경 (TEM; transmission electron microscopy)을 이용하여 분리된 EVs morphology 분석 ● Dynamic light scattering를 통한 EVs의 크기 분포 분석 □ 2차 년도 □□ 줄기세포 EVs의 proteomics 분석 ● 상기의 방법으로 분리된 EVs를 soluble factor 분석과 마찬가지로 프로테오믹스 기법을 활용하여 단백체 (proteome) 발현 패턴 분석 및 biological function analysis를 실시함 ● 치주조직재생에 관여하는 pathways 및 이들의 network을 분석함. ● Soluble factor vs. EVs proteome 발현을 비교 분석하여 데이터 구축 □□ 치주질환 세포 모델을 이용한 줄기세포 secretome의 세포활성 조절 분석 ● 치주인대줄기세포에 Lipopolyssacharide (LPS)를 처리하여 치주질환세포 모델로 사용함. ● Soluble factor의 세포활성 회복 효능 평가: 상기의 방법으로 농축된 CM 상층액을 각각 2, 5, 10배로 희석한 배양액에 치주인대줄기세포를 배양하여 LPS에 의한 줄기세포의 저하된 세포활성의 회복 평가. ● EVs의 세포활성 회복 효능 평가: EVs를 농도별 (5, 10, 25 μg/ml)로 줄기세포에 처리하여 세포 활성 회복 분석. ● 세포활성 평가 실험에는 먼저 세포 증식에 대한 각 secretome의 역할을 CCK-8 assay 실시, 분석함. ● 또한 골분화 표지 효소인 alkaline phosphatase activity (ALP)와 세포 내 칼슘 농도 측정 및 세포외 기질의 mineralization 측정 (alizarin red s staining)등을 실시하여 각 secretome의 줄기세포 골분화에 대한 효능 검증함. ● Western blotting을 실시하여 치주조직 표지 단백질인 (PDL tissue markers)의 발현을 분석함. ● 다양한 분자세포생물학적 기법을 이용하여 각 secretome의 줄기세포 활성 회복에 관여하는 특이적 바이오마커 비교 분석 ● 전사체 차세대 서열 분석을 통한 각 secretome 특이적 골분화 관련 유전자 (mRNA 및 small RNA) 동정 및 비교 분석 ● Pathways 및 network-based analysis를 통해 soluble factor vs. EVs proteome 비교 분석 □ 3차 년도 □□ 줄기세포 secretome 기반 Cell-free scaffold의 생체활성도 분석 ● Periodontal defect 랫드 모델 제작 ● 8주령의 Sprague–Dawley rats의 left, right maxillary first molars를 발치하여 periodontal osseous defect 모델 제작 ● Collagen sponge를 각각의 CM과 EVs 용액에 12시간 이상 soaking (침지) 후 collagen sponge, collagen + CM, collagen + EVs 3종류의 scaffold를 제작하여 동물모델에 이식 ● Micro-CT Tomography Analysis 및 조직면역염색법을 이용하여 골 재생 효능 검증

본 연구는 홍합 접착단백질의 카테콜 작용기 도파민(dopamine)과 graphene 혼합물을 제작하고 기질에 매우 쉽고 경제적인 그래핀 코팅 방법으로 적용해 생체계면(biointerface)을 형성하는 연구임. 이를 통해 배아줄기세포의 골분화 제어 및 조절 기전 분석이 연구 목표임. 1~3차년도에서 폴리도파민-그래핀 바이오인터페이스의 줄기세포 생리활성·골분화 평가, 골분화 성장인자 방출형 나노입자 고정화 나노바이오인터페이스 제작 및 기능 평가 수행함. RNA sequencing 및 mRNA·small RNA 등 전사체(transcriptome) 분석으로 특이적 골분화 조절 메커니즘 규명 기대됨. 동종성 높은 분화 시스템 및 치료용 줄기세포 대량 생산 스크리닝 기반 확보 기대됨.