목적: 치수 기질 줄기세포(dental mesenchymal stem cells, MSCs)의 조건배지(conditioned medium, CM)에서 분비되는 분비 인자(secretome)는 항염증, 항세포사멸 및 조직 재생 가능성을 보여 왔다. 무세포 제제인 이 생성물은 다양한 생화학적 제제로 세포를 전처치(preconditioning)함으로써 secretome 및 CM의 조성/프로파일을 변화시켜 한층 더 개발될 수 있다. CM 생산에 유리한 후보 중, 항당뇨제인 메트포르민은 치아 경조직 및 치주 재생을 위한 잠재적 제제로 현재 고려되고 있다. 본 연구에서는 메트포르민 전처치 배지(metformin-preconditioned media)에서 배양한 치주인대 줄기세포(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)의 CM(Met-CM) 조성을 정상 PDLSC-CM과 비교하여 평가하고, Met-CM이 염증이 유발된 PDLSCs의 기능을 회복할 수 있는 능력을 평가하고자 하였다. 방법: 염증을 유도한 후, Met-CM 또는 정상 PDLSC-CM의 존재 하에 조골/백악질 분화능을 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase) 활성, 세포내 칼슘 수준, 그리고 RUNX2, OCN, OSX, CEMP-1을 포함하는 조골 및 백악질 관련 인자의 mRNA 발현을 평가하여 분석하였다. 이어서 RNA sequencing을 수행하여 처리된 세포에서 전사체(transcriptome) 변화가 있는지 확인하였다. 결과: 대조군 대비 Met-CM 처리군에서 RUNX2, OCN, OSX 및 CEMP-1의 mRNA 발현 수준이 증가하였으며, 또한 Met-CM 단독 처리는 대조군에 비해 PDLSC의 분화 활성(differentiation activity)을 현저히 강화하였다. 더 나아가 LPS로 처리한 PDLSCs의 조골/백악질 분화는 Met-CM에서 배양함으로써 회복되었다. 전사체 분석 결과, 대조군 대비 Met-CM 군에서 511개, LPS 처리군 대 LPS+Met-CM 처리군에서 3591개의 차등 발현 유전자(differentially expressed genes)가 확인되었다. 생물학적 과정(biological processes) 풍부성 분석에서는 대조군 대 Met-CM 비교에서 DNA 주형 전사(dNA-templated transcription)의 양성 조절 및 골격계 형태형성(skeletal system morphogenesis)의 양성 조절이 포함되었고, LPS 대 LPS+Met-CM 비교에서는 RNA polymerase II 프로모터로부터의 전사에 대한 양성 조절 및 세포사멸(apoptotic process)에 대한 음성 조절이 포함되었다. 분자 기능(molecular function) 분석은 각 비교에서 DEGs로부터 단백질 결합(protein-binding) 관련 용어의 풍부함이 확인되었음을 보여주었다. 결론: 메트포르민 전처치는 LPS로 유도된 염증성 PDLSCs에서 PDLSC-CM의 회복 효과를 향상시켰다. 이러한 결과는 메트포르민 전처치가 PDLSC secretome을 위한 실용적인 제형을 대표할 수 있으며, 향후 무세포성 치주 재생 전략의 개발에 기여할 수 있음을 시사한다.

배경: 치주인대 줄기세포(Periodontal ligament stem cells, PDLSCs)는 치주질환 및 치주 결손에서 치료 후보로 제안되어 왔다. PDLSCs의 파라크린 인자, 즉 시크레토메(secretome)는 직접적인 줄기세포 적용에 준하는 조직 재생에 기여할 수 있다. 본 연구는 염증성 미세환경에서 PDLSC 자신에 대한 PDLSC 유래 시크레토메/컨디셔닝 배지(조건배지; PDLSC-CM)의 회복 효과를 탐색하고, 프로테오믹스 및 전사체(profiling) 분석을 통해 그 작용 기전을 규명하고자 하였다. 방법: PDLSC-CM은 건강한 배양 조건에서 세포로부터 준비하였다. 이후 질량분석기(mass spectrometry) 및 액체크로마토그래피-탠덤 질량분석기(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)를 수행하여 PDLSC-CM의 프로테옴을 분석하였다. 이어서 염증 조건하 또는 PDLSC-CM의 존재 하에서 PDLSC의 골분화(osteogenic differentiation)를 알칼리성 포스파타아제 활성, 세포 내 칼슘 수준, 골분화 마커의 단백질 발현, 기질 광물화(matrix mineralization) 분석을 통해 특성화하였다. 또한 RNA sequencing을 통해 유의하게 농축(enriched)된 신호전달 경로 및 관련 분자 네트워크를 확인하기 위해 전사체 프로파일을 평가하였다. 결과: LC-MS/MS 프로테오믹스 분석을 통해 총 203개의 단백질이 확인되었고, 대조군(대조-CM) 대비 PDLSC-CM에서는 187개의 유의한 단백질 변화가 구별되었다. LPS 처리한 PDLSC는 골분화를 유의하게 저해하였다. PDLSC가 PDLSC-CM만으로 처리되었을 때, 그 골분화 활성은 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 또한 LPS로 손상된 PDLSC의 골형성은 PDLSC-CM 처치로 회복되었다. RNA sequencing 결과, 대조군 대 LPS, 대조군 대 PDLSC-CM, 및 LPS 대 LPS + PDLSC-CM 군에서 각각 252개, 1,326개, 776개의 차등 발현 유전자가 확인되었다. 결론: 본 연구는 시크레토리(secretory) 기능을 통해 염증성 환경에서 PDLSC의 골분화 잠재력을 회복시킬 수 있으며, 이는 잠재적 수복 및 재생 기전을 나타낸다고 제안한다.

= 348)은 푸코이단/PDA 유도 골분화 과정에서 RNA sequencing을 통해 확인되었다. DEGs에서 풍부하게 나타난 신호전달 경로에는 액틴 세포골격의 조절, Ras 관련 단백질 1, 그리고 인지질리노시톨 신호전달이 포함된다. 이들 경로는 골분화 과정에 유의미하게 관여하는 세포 부착 및 세포골격 조직 기능을 나타낸다. 이러한 결과는 푸코이단/PDA 복합체가 핵심 분자 경로의 활성화를 통해 PDLSCs의 골형성 잠재력을 촉진함을 시사한다.

그래핀 옥사이드(GO)는 생체적합성이 있는 물질로, 유리한 줄기세포 배양 기질로 간주된다. 본 연구에서는 조직 배양 폴리스티렌(PT) 표면에 GO를 용이하게 침착시키기 위하여 GO를 폴리도파민(PDA)으로 변형하였고, 다능성 배아줄기세포(ESCs)에서 PDA/GO 복합체의 골형성(osteogenic) 성능을 조사하였다. PDA/GO 코팅 PT 표면의 표면 화학적 특성은 주사전자현미경(SEM)과 X선 광전자분광법(XPS)을 통해 분석하였다. 처음으로 PDA/GO 복합체 코팅 표면에서 배양한 ESC의 높은 세포 생존율을 확인하였다. 이후, PDA/GO 기질에 대한 ESC의 골형성 분화는 알칼라인 포스파타아제(ALP) 활성, 세포내 칼슘 수준, 매트릭스 광물화 분석, 그리고 골형성 인자의 mRNA 및 단백질 수준의 평가를 통해 분석하였다. PDA/GO 기질에서 배양한 ESC는 무코팅 대조 표면에서 배양한 경우보다 더 높은 골형성 능력을 보였다. 또한 ESCs는 대조군과 비교하여 PDA/GO 기질에서 배양 시 integrin α5 및 β1, 그리고 골형성 단백질 수용체(bone morphogenetic protein receptor, BMPR) I형 및 II형의 발현이 유의하게 더 높았다. PDA/GO 기질에서 배양한 ESC에서는 세포외 신호 조절 키나아제(extracellular signal-regulated kinase, ERK)1/2, p38, 및 c-Jun-N-terminal kinase(JNK) MAPK(mitogen-activated protein kinase)들의 인산화가 관찰되었다. 더 나아가, PDA/GO 기질에서는 대조군에 비해 SMAD1/5/8 인산화를 통한 BMP 신호 전달이 더 크게 증가하였다. 세포에서의 SMAD1/5/8의 핵 내 이동 또한 PDA/GO 기질에 반응하여 처리되었다. integrin α5/β1, MAPK 또는 SMAD 신호전달 경로의 활성화를 차단하면 PDA/GO에 의해 유도된 ESC의 골형성 분화가 하향 조절되었다. 이러한 결과는 PDA/GO 복합체가 integrin α5/β1, MAPK 및 BMPR/SMAD 신호전달 경로를 통해 ESC의 골형성 분화를 자극함을 시사한다.

목적: 치수 기질 줄기세포(dental mesenchymal stem cells, MSCs)의 조건배지(conditioned medium, CM)에서 분비되는 분비 인자(secretome)는 항염증, 항세포사멸 및 조직 재생 가능성을 보여 왔다. 무세포 제제인 이 생성물은 다양한 생화학적 제제로 세포를 전처치(preconditioning)함으로써 secretome 및 CM의 조성/프로파일을 변화시켜 한층 더 개발될 수 있다. CM 생산에 유리한 후보 중, 항당뇨제인 메트포르민은 치아 경조직 및 치주 재생을 위한 잠재적 제제로 현재 고려되고 있다. 본 연구에서는 메트포르민 전처치 배지(metformin-preconditioned media)에서 배양한 치주인대 줄기세포(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)의 CM(Met-CM) 조성을 정상 PDLSC-CM과 비교하여 평가하고, Met-CM이 염증이 유발된 PDLSCs의 기능을 회복할 수 있는 능력을 평가하고자 하였다. 방법: 염증을 유도한 후, Met-CM 또는 정상 PDLSC-CM의 존재 하에 조골/백악질 분화능을 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase) 활성, 세포내 칼슘 수준, 그리고 RUNX2, OCN, OSX, CEMP-1을 포함하는 조골 및 백악질 관련 인자의 mRNA 발현을 평가하여 분석하였다. 이어서 RNA sequencing을 수행하여 처리된 세포에서 전사체(transcriptome) 변화가 있는지 확인하였다. 결과: 대조군 대비 Met-CM 처리군에서 RUNX2, OCN, OSX 및 CEMP-1의 mRNA 발현 수준이 증가하였으며, 또한 Met-CM 단독 처리는 대조군에 비해 PDLSC의 분화 활성(differentiation activity)을 현저히 강화하였다. 더 나아가 LPS로 처리한 PDLSCs의 조골/백악질 분화는 Met-CM에서 배양함으로써 회복되었다. 전사체 분석 결과, 대조군 대비 Met-CM 군에서 511개, LPS 처리군 대 LPS+Met-CM 처리군에서 3591개의 차등 발현 유전자(differentially expressed genes)가 확인되었다. 생물학적 과정(biological processes) 풍부성 분석에서는 대조군 대 Met-CM 비교에서 DNA 주형 전사(dNA-templated transcription)의 양성 조절 및 골격계 형태형성(skeletal system morphogenesis)의 양성 조절이 포함되었고, LPS 대 LPS+Met-CM 비교에서는 RNA polymerase II 프로모터로부터의 전사에 대한 양성 조절 및 세포사멸(apoptotic process)에 대한 음성 조절이 포함되었다. 분자 기능(molecular function) 분석은 각 비교에서 DEGs로부터 단백질 결합(protein-binding) 관련 용어의 풍부함이 확인되었음을 보여주었다. 결론: 메트포르민 전처치는 LPS로 유도된 염증성 PDLSCs에서 PDLSC-CM의 회복 효과를 향상시켰다. 이러한 결과는 메트포르민 전처치가 PDLSC secretome을 위한 실용적인 제형을 대표할 수 있으며, 향후 무세포성 치주 재생 전략의 개발에 기여할 수 있음을 시사한다.

배경: 치주인대 줄기세포(Periodontal ligament stem cells, PDLSCs)는 치주질환 및 치주 결손에서 치료 후보로 제안되어 왔다. PDLSCs의 파라크린 인자, 즉 시크레토메(secretome)는 직접적인 줄기세포 적용에 준하는 조직 재생에 기여할 수 있다. 본 연구는 염증성 미세환경에서 PDLSC 자신에 대한 PDLSC 유래 시크레토메/컨디셔닝 배지(조건배지; PDLSC-CM)의 회복 효과를 탐색하고, 프로테오믹스 및 전사체(profiling) 분석을 통해 그 작용 기전을 규명하고자 하였다. 방법: PDLSC-CM은 건강한 배양 조건에서 세포로부터 준비하였다. 이후 질량분석기(mass spectrometry) 및 액체크로마토그래피-탠덤 질량분석기(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)를 수행하여 PDLSC-CM의 프로테옴을 분석하였다. 이어서 염증 조건하 또는 PDLSC-CM의 존재 하에서 PDLSC의 골분화(osteogenic differentiation)를 알칼리성 포스파타아제 활성, 세포 내 칼슘 수준, 골분화 마커의 단백질 발현, 기질 광물화(matrix mineralization) 분석을 통해 특성화하였다. 또한 RNA sequencing을 통해 유의하게 농축(enriched)된 신호전달 경로 및 관련 분자 네트워크를 확인하기 위해 전사체 프로파일을 평가하였다. 결과: LC-MS/MS 프로테오믹스 분석을 통해 총 203개의 단백질이 확인되었고, 대조군(대조-CM) 대비 PDLSC-CM에서는 187개의 유의한 단백질 변화가 구별되었다. LPS 처리한 PDLSC는 골분화를 유의하게 저해하였다. PDLSC가 PDLSC-CM만으로 처리되었을 때, 그 골분화 활성은 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 또한 LPS로 손상된 PDLSC의 골형성은 PDLSC-CM 처치로 회복되었다. RNA sequencing 결과, 대조군 대 LPS, 대조군 대 PDLSC-CM, 및 LPS 대 LPS + PDLSC-CM 군에서 각각 252개, 1,326개, 776개의 차등 발현 유전자가 확인되었다. 결론: 본 연구는 시크레토리(secretory) 기능을 통해 염증성 환경에서 PDLSC의 골분화 잠재력을 회복시킬 수 있으며, 이는 잠재적 수복 및 재생 기전을 나타낸다고 제안한다.

= 348)은 푸코이단/PDA 유도 골분화 과정에서 RNA sequencing을 통해 확인되었다. DEGs에서 풍부하게 나타난 신호전달 경로에는 액틴 세포골격의 조절, Ras 관련 단백질 1, 그리고 인지질리노시톨 신호전달이 포함된다. 이들 경로는 골분화 과정에 유의미하게 관여하는 세포 부착 및 세포골격 조직 기능을 나타낸다. 이러한 결과는 푸코이단/PDA 복합체가 핵심 분자 경로의 활성화를 통해 PDLSCs의 골형성 잠재력을 촉진함을 시사한다.

그래핀 옥사이드(GO)는 생체적합성이 있는 물질로, 유리한 줄기세포 배양 기질로 간주된다. 본 연구에서는 조직 배양 폴리스티렌(PT) 표면에 GO를 용이하게 침착시키기 위하여 GO를 폴리도파민(PDA)으로 변형하였고, 다능성 배아줄기세포(ESCs)에서 PDA/GO 복합체의 골형성(osteogenic) 성능을 조사하였다. PDA/GO 코팅 PT 표면의 표면 화학적 특성은 주사전자현미경(SEM)과 X선 광전자분광법(XPS)을 통해 분석하였다. 처음으로 PDA/GO 복합체 코팅 표면에서 배양한 ESC의 높은 세포 생존율을 확인하였다. 이후, PDA/GO 기질에 대한 ESC의 골형성 분화는 알칼라인 포스파타아제(ALP) 활성, 세포내 칼슘 수준, 매트릭스 광물화 분석, 그리고 골형성 인자의 mRNA 및 단백질 수준의 평가를 통해 분석하였다. PDA/GO 기질에서 배양한 ESC는 무코팅 대조 표면에서 배양한 경우보다 더 높은 골형성 능력을 보였다. 또한 ESCs는 대조군과 비교하여 PDA/GO 기질에서 배양 시 integrin α5 및 β1, 그리고 골형성 단백질 수용체(bone morphogenetic protein receptor, BMPR) I형 및 II형의 발현이 유의하게 더 높았다. PDA/GO 기질에서 배양한 ESC에서는 세포외 신호 조절 키나아제(extracellular signal-regulated kinase, ERK)1/2, p38, 및 c-Jun-N-terminal kinase(JNK) MAPK(mitogen-activated protein kinase)들의 인산화가 관찰되었다. 더 나아가, PDA/GO 기질에서는 대조군에 비해 SMAD1/5/8 인산화를 통한 BMP 신호 전달이 더 크게 증가하였다. 세포에서의 SMAD1/5/8의 핵 내 이동 또한 PDA/GO 기질에 반응하여 처리되었다. integrin α5/β1, MAPK 또는 SMAD 신호전달 경로의 활성화를 차단하면 PDA/GO에 의해 유도된 ESC의 골형성 분화가 하향 조절되었다. 이러한 결과는 PDA/GO 복합체가 integrin α5/β1, MAPK 및 BMPR/SMAD 신호전달 경로를 통해 ESC의 골형성 분화를 자극함을 시사한다.

배경/목적: 푸코이단은 뼈 건강 보충제 등을 포함하는 다기능 치료제로 주목받고 있다. 그러나 뼈 치료제에 대한 푸코이단의 핵심 분자 기전은 아직 충분히 이해되지 않았다. 본 연구는 치주인대줄기세포(PDLSCs)에서 푸코이단의 골유도(osteoinductive) 효과와, 이 고분자가 PDLSC의 골형성을 어떻게 촉진하는지 알아보고자 하였다. 재료 및 방법: PDLSC의 골유도는 푸코이단 처리로 세포를 배양하여 수행하였다. PDLSC의 골분화는 알칼리성 포스파타아제(ALP) 활성, 기질 광물화 분석, 세포내 칼슘 수준, 그리고 골유도 관련 마커의 mRNA 및 단백질 발현을 통해 확인하였다. 결과: 푸코이단 처리군은 대조군에 비해 PDLSC에서 더 높은 골유도 활성을 보였다. 또한 푸코이단을 처리한 PDLSC는 대조 세포에 비해 인산지질이노시톨-3-키나아제(PI3K) 동형인 p110α와 p110γ의 수준이 증가하였다. PI3K의 하위 신호전달 인자인 Akt의 인산화는 푸코이단 유도 90분 시점에서 유의하게 증가하였다. 표준(canonical) Wnt 경로의 공동활성화 인자인 β-catenin의 발현은 푸코이단 처리된 PDLSC에서 증가하였다. β-catenin은 푸코이단 자극 동안 PI3K 활성과 연관되는 것으로 확인되었다. 세포를 PI3K 억제제 또는 β-catenin 특이적 siRNA로 차단하였을 때, 푸코이단에 의해 유도된 PDLSC의 골유도 활성은 유의하게 감소하였다. 결론: 본 연구의 결과는 푸코이단이 PI3K/Akt 및 Wnt/β-catenin 경로를 통해 PDLSC의 골분화를 자극함을 시사한다.

-NP는 NF-κB 신호전달의 활성화를 통해 COX-2 발현을 유도하며, 이는 PDL 세포의 염증 효과에 기여할 수 있다.

배경/목적: 본 연구는 유도성 nitric oxide synthase-적재 미네랄화 나노입자(inducible nitric oxide synthase-loaded mineralized nanoparticles, iNOS-MNPs)가 마우스 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)의 골분화(osteogenic differentiation)에 미치는 영향을 조사하였다. 방법: 우리는 iNOS 존재 하에서 음이온성 블록 공중합체 템플릿 매개 탄산칼슘(CaCO3) 미네랄화 공정을 이용하여 iNOS-MNPs를 제조하였다. iNOS-MNPs는 구형이며 크기 분포가 좁았다. iNOS는 변성 없이 MNP 내부에 안정적으로 적재되었다. ESCs의 세포질(cytosol)로 iNOS-MNPs가 성공적으로 도입되었는지를 확인하기 위해, 형광 분석으로 세포 내 일산화질소(nitric oxide, NO) 수준을 측정하였다. 또한 NO 효능 분자(effector molecule)인 사이클릭 구아노신 3',5'-모노포스페이트(cyclic guanosine 3',5' monophosphate, cGMP)도 경쟁 효소 면역분석법(competitive enzyme immunoassay)으로 정량하였다. iNOS-MNP 처리에 대한 세포 생존율은 cell counting kit-8(CCK-8) 분석을 사용하여 평가하였다. ESCs의 골분화를 조사하기 위해 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase, ALP) 활성 분석, 세포내 칼슘 정량 분석, 그리고 기질 미네랄화(matrix mineralization)를 위한 Alizarin red S 염색을 수행하였다. 또한 골분화 관련 인자인 Runt-related transcription factor 2(RUNX2), 오스테오칼신(osteocalcin, OCN), 오스테릭스(osterix, OSX)의 단백질 수준은 면역형광 염색 및 Western blot 분석을 통해 평가하였다. iNOS-MNP 유래 골분화와 관련된 복합 경로는 네트워크 기반 분석(network-based analysis)으로 평가하였다. 결과: iNOS-MNP를 포함한 세포는 대조군에 비해 NO와 cGMP 농도가 유의하게 증가하였다. 세포를 iNOS-MNP에 노출하였을 때 세포 생존율에 대한 부작용은 관찰되지 않았다. 특히 iNOS-MNP의 흡수는 ESCs의 골분화를 촉진하였다. 전사체(transcriptome) 프로파일링을 통해 1,836개의 차등 유도 유전자(differentially-induced genes)를 확보하였고, ClueGO 및 KEGG를 이용한 기능 농축 분석을 수행하였다. 이러한 분석을 통해 단백질 키나아제 활성(protein kinase activity), 에스트로겐 수용체 활성(estrogen receptor activity), 골형태형성단백질(bone morphogenetic protein, BMP) 수용체 결합(BMP receptor binding), 리간드 개폐 이온 채널(ligand-gated ion channel) 활성, 포스파티딜이노시톨 3-인산(phosphatidylinositol 3-phosphate) 결합 등 유의하게 농축되고 서로 연결된 분자 경로가 확인되었다. 결론: 본 연구 결과는 iNOS-MNP가 복합 신호 전달 경로를 통합하여 ESCs에서 골분화를 유도할 수 있음을 시사한다.