선행연구에서 KRAS 돌연변이 폐암 세포 특이적으로 1) HBP 대사 경로 및 KRAS의 활성을 조절하는 것으로 도출된 핵심 후보 인자 G의 임상적 유효성을 검증하여 'G의 예후 인자 및 치료 표적으로의 가능성을 제시하고, 인자 G 또는 MDM2-A에 의한 2) HBP 대사 경로가 면역치료의 중요 표적인 PD-L1의 N-linked glycosylation...

[1/2차년도: 선행연구에서 도출된 MDM2-A의 항암 효과와 ferroptosis 유도 검증 ( in vitro & in vivo ) 및 연관 핵심 인자 도출] 1. MDM2-A 반응양상에 따른 세포주 모델을 이용하여 MDM2-A 처리 후 ( in vitro ) • 세포 생존, 증식, 사멸, 이동, 침투, 세포주기 변화 등 암 악성화 연관 표현형 비교 분석 • Ferroptosis 연관 표현형 (세포막 변화, 마이토콘드리아 모양 변호등), ROS, lipid peroxidation, GSH등의 변화 비교 분석 • 다른 ferroptosis 유도 물질에 대한 반응과 비교 분석 • 위와 연관된 다양한 인자들의 발현 변화 분석 • 다양한 세포생물/생화학적 방법 및 이미지 분석 방법 이용 2. 동물 모델 ( in vivo )을 이용하여 도출된 후보 항암물질 MDM2-A의 KRAS 돌연변이 세포 특이적 항암 효과 및 ferroptosis 검증: 종양의 크기, 침투, 전이, 혈관 형성, ferroptosis 표지자 등 확인 3. 발현체 분석을 이용하여, KRAS 돌연변이 폐암 특이적 항암/ferroptosis 연관 핵심 인자 도출 [3차년도: 도출된 핵심후보인자의 KRAS 돌연변이 폐암 특이적 역할 및 ferroptosis 에 미치는 효과와 기전 분석 (in vitro & in vivo) ] 1. 도출된 핵심후보인자의 발현 조절 세포주를 구축하여 ( in vitro ) • 암 악성화 및 ferroptosis 연관 표현형 및 대사물질/상태 비교 분석 • KRAS, MDM2-p53, ferroptosis 등 연관 신호전달 및 표지자의 발현 변화 비교 분석 • MDM2-A와 다른 ferroptosis 유도제 및 저해제들에 대한 세포 생존률등 반응성 비교 분석 2. 동물 모델을 ( in vivo ) 이용 하여 도출된 후보 핵심인자의 항암 및 ferroptosis 에 미치는 영향 검증 [4차년도: KRAS, MDM2-p53, 도출된 핵심인자의 상호관계 및 ferroptosis 유도 기전 규명] 1. KRAS 돌연변이, MDM2-p53, 도출된 핵심후보인자의 상태 및 발현 조절 세포주 모델을 구축하여 • 연관 신호전달계와 ferroptosis 표지자들의 발현 양상 비교 분석 • 분자적 수준에서 이들 분자들의 상호관계 (발현 조절 기전, DNA-단백질 결합, 단백질-단백질 결 합등) 분석 • 이들 상호관계 조절에 따른 ferroptosis 유도 여부 분석 • 다양한 분자세포생물학적 방법 ( IP, CHIP, FACS, ICS, qRT-PCR, western blotting등 )

[1차년도: 구축된 KRAS 돌연변이 폐암 세포 모델을 이용하여 대사 조절 물질·치료제의 항암효과 분석을 통한 후보 항암제 및 KRAS 돌연변이 특이적인 후보 대사 조절 인자 (들) 도출] 1. 동형접합 (Homozygous) KRAS 돌연변이 폐암 세포주 (HCC827KRAS)를 구축하여 모세포 (HCC827)와의 유전자 발현을 비교 분석하여 대사 조절 후보 인자들을 분석 (현재 구축하여 후보 대사 조절 후보 인자들을 분석하고 있음). 2. 분석된 대사 조절 후보 인자들에 의하여 조절되는 대사 과정에 효과가 있는 적절한 대사 조절 물질들을 선별함 (현재 5가지 선별하였음). 3. 구축된 KRAS 돌연변이 세포 (HCC827KRAS), 모세포 (HCC827), 정상 폐 세포주 (BEAS-2B)에 선별된 대사조절 물질들의 항암 효과 (세포 생존, 증식, 사멸, KRAS 신호 전달계등)를 분석하여 대사 조절 후보항암제 도출. 4. 도출된 대사 조절 후보항암제에 의한 구축된 KRAS 돌연변이 세포주 (HCC827KRAS)의 대사체 및 발현체 분석을 통하여 KRAS 돌연변이 세포의 특이적인 KRAS 신호전달, 대사과정 및 후보 핵심 대사 조절 인자(들)을 도출. 5. 도출된 대사 조절 후보항암제의 효과와 후보 핵심 대사조절 인자(들)의 유용성을 다른 KRAS 돌연변이 폐암 세포 주들과 KRAS 비 돌연변이 폐암 세포 주들에서 검증. [2차년도: 세포 주 모델을 이용하여 도출된 핵심 대사 조절 인자가 KRAS 돌연변이 폐암세포의 특이적이고 비정상적인 대사와 항암 작용에 미치는 효과 및 기전 규명] 1. 도출된 후보 핵심 대사 조절인자가 세포 증식 (proliferation), 생존 (survival), 사멸 (apoptosis), 이동 (migration), 침투 (invasion) 및 상피-간엽세포 전이 (EMT)등 암의 악성화 및 항암 작용에 미치는 효과 및 기전 규명 2. KRAS를 포함한 다양한 신호전달계 및 대사 조절 등에 미치는 효과 및 기전 규명 3. 도출된 핵심 대사 조절 인자의 성격 (과발현/저발현)에 따라 환자의 조직샘플을 이용하여 유용성 확인 [3차년도: 동물 모델 (in vivo)을 이용하여 도출된 대사 조절 후보항암제 및 핵심 대사 조절 인자 조절에 따른 항암 효과 검증] 1. KRAS 돌연변이 폐암 세포를 Zebrafish에 이식하여 도출된 대사 조절 후보 항암제 및 핵심 대사 조절인자에 따른 항암 효과 검증: 종양의 크기, 침투, 전이, 혈관 형성등 확인. 2. KRAS 돌연변이 폐암 세포를 면역결핍생쥐에 이식한 지노그라프트 생쥐에서 도출된 대사 조절 후보 항암제 및 대사 조절 인자에 따른 항암 효과 검증: 종양의 크기, 생존률, 표지자등 확인. 3. 본 연구에서 검증된 대사 조절 후보 항암제 및 대사 조절 인자의 조절이 KRAS 돌연변이를 보유하는 다른 종류의 암 세포 주 (특히, 췌장암) 모델에서의 효과 분석을 통한 응용 가능성 여부 검토

1차 년도 1. 암 환자 유래 1차 배양세포에서 천연물 유래 항암제 후보 및 감수성 핵심 표적인자 발굴 암 환자 유래 1차 배양세포 및 천연물 유래 약물 확보 암 환자 유래 1차 배양세포의 천연물 유래 약물의 항암 반응성 평가를 통한 항암제 후보 발굴 발굴된 후보 항암제 처리 전 후의 유전체/전사체 분석 후보 항암제 감수성 관련 핵심 표적 유전자 및 돌연변이 발굴 2차 년도 1. 선별된 후보 항암제의 효과 유무에 따른 다른 핵심 표적 인자 및 후보 항암제 발굴 1차 년도에서 선별된 후보 항암제에 효과가 없는 환자 유래 1차 배양세포를 대상으로 유전체/전사체를 분석 항암 효과가 있는 환자유래 배양세포의 유전체/전사체와 비교 분석하여 서로 다른 항암제 감수성 핵심 표적 인자 발굴 새로운 핵심 표적인자에 항암 효과가 있는 다른 천연물 유래 후보 항암제 선별 2. 발굴된 핵심 표적 인자들의 in vitro 검증 및 상호관계 네트워크 분석 서로 다른 항암제에 감수성을 갖는 서로 다른 핵심 표적인자들이 과 발현/발현 억제 모델 세포주 구축 핵심 표적인자에 따른 선별된 천연물 유래 약물의 항암제 유효성 검증 서로 다른 핵심 표적인자들의 항암제 감수성 및 상호관계 생체 네트워크 분석 3차 년도 1. 최적의 천연물 조합 항암제 도출 및 항암 효과 기전 규명 1-2차 년도의 결과를 기준으로 최적의 천연물 조합 다중표적 항암제 도출 In vitro 모델 및 전사체 분석을 통하여 다중표적 항암제의 복합 항암제 효과 검증 및 작용 기전 규명