다중기능성 단백질-나노입자 하이브리드 마이크로캡슐 개발을 통한 암 제어용 약물전달체 제작 연구
본 과제가 목표하는 다중기능성 마이크로캡슐은 외부자기장에 반응하는 MNP, 캡슐 크기 제어를 통한 EPR 효과, 표면에 고정화된 신장암 세포마커 Neprilysin에 대한 항체 등을 활용한 암표적화가 가능하며, 암조직 특이적으로 발현하는 Matrix Metalloproteinase에 의한 암특이적 약물방출과 친수/소수성 약물 및 세포내로 포획/유입된 캡슐조각/나노입자의 광열효과에 따른 암세포 사멸유도 등의 특성을 나타낼 것으로 기대되며, 이와 같은 암선택적 특성은 다음과 같은 일련의 연구를 통하여 확인할 계획임. (1) 마이크로캡슐-구성 나노입자 다양화: aS-CNT 또는 aS-MNP를 활용한 마이크로캡슐 제작과 CNT/AuNP, MNP/AuNP, CNT/MNP의 하이브리드 마이크로캡슐 제작; (2) 마이크로캡슐 표면기능화: 암표적용 항체의 방향특이적 표면고정화, aS-상호작용성 약물 및 광역동-치료용 감응제 고정화; (3) 마이크로캡슐 내부도입: 역미셀 구조체를 활용한 친수성 약물 도입, 내부 Chloroform 층으로의 소수성 약물과 발광형 양자점 도입; (4) 암특이적 활성 검증: 신장암 세포주(Caki-1, Caki-2, ACHN, A489, A704)와 이종이식 마우스 종양모델 및 신장피막하 암전이 모델을 이용한 암선택적 치료효과 분석.
위암에서 차세대 면역 치료제 개발을 위한 면역억제 단백질 발현 조절 전사인자 IRF-1의 활성화 기전 규명
1) EBV 양성 위암 세포주 모델에서 IFNγ 자극에 의한 EBNA-1, IDO-1, CIITA 단백질 발현의 신호전달 경로를 규명하고자 한다. 주로 EBV 양성세포주에 JAK2, STAT1 저해제 처리, 그리고 JAK2, STAT1, IRF-1 siRNA 처리후 각 유전자들의 mRNA, 단백질, 프로모터 활성 변화를 관찰한다.
2) 선행연구에서 밝혀낸 IFNγ 유도 PD-L1 과발현의 신호전달 경로에서 최종 단계 전사 인자인 IRF-1의 활성화 기전을 밝히고자 한다. 주로 IFNγ로 자극한 EBV 양성 위암 세포주에서 IRF-1 항체로 면역 침강 후 tyrosine 인산화 항체로 Western blot을 시행하여 IRF-1의 인산화 여부를 관찰하고 단백질-이합체 footprinting과 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)을 통해 IRF-1의 이합체 형성 여부를 확인한다.
(1년차)
1) PD-L1 단백질의 발현이 낮은 위암 세포주 MKN1과 SNU601을 대상으로 재조합 IFN γ를 처리하여 PD-L1 단백질의 발현을 증가시킨 후 JAK/STAT 신호 전달 경로 단백질들의 발현 변화 분석.
2) PD-L1의 발현이 높은 위암 세포주 AGS와 MKN28을 대상으로 JAK2, STAT1 억제제 처리를 통해 PD-L1의 발현 및 PD-L1 단백질의 과발현 및 넉다운 실험을 통해 위암 세포내에서 PD-L1의 하부 신호전달 경로를 확인.
3) STAT1, IRF1 단백질에 의한 PD-L1 유전자의 프로모터 활성도 변화 측정과 직접적으로 결합하는 유전자 서열 분석을 통해 PD-L1 단백질 발현의 전사 단계에서 조절 여부 확인.
4) EBNA1과 PD-L1 발현이 높은 EBV 양성 위암 세포주 SNU719에 EBNA1 발현 저하을 통해 JAK/STAT, JNK, RAS, NF-kB 신호 전달 단백질의 발현 변화 및 하위 표적 단백질인 PD-L1의 발현 변화 분석.
5) EBV 양성 위암 세포주에 EBNA1 과발현 및 넉다운에 따른 PD-L1 단백질 발현 조절 확인 및 PD-L1 과발현 및 넉다운 실험을 통해 EBV 양성 위암 세포주에 미치는 작용기전 확인.
(2년차)
1) EBNA1 과발현 및 넉다운 실험을 통해 JAK2 단백질 조절 메카니즘 확인을 통해 EBV 양성 위암 세포주에서의 EBNA1-PD-L1 조절 기전 분석.
2) Chemical library 처리를 통해 JAK2/STAT1/IRF-1/PD-L1 신호 전달 조절기전을 억제할 수 있는 저분자 억제제를 발굴함으로서 위암 환자 치료에 사용 가능한 약물의 리드 후보 물질 발굴.
3) Chemical library 처리를 통해 PD-L1 및 EBNA1 단백질 결합 억제제 발굴과 위암 세포 및 위암 조직을 대상으로 민감도 및 특이성 확인.
4) PD-L1 결합 저분자 억제제를 위암세포주에 처리한 후 위암세포의 성장, 세포주기, 사멸, 세포이동 조절기전 분석.
(3년차)
1) PD-L1의 발현이 높은 위암세포주(AGS, MKN28)와 PD-L1 발현억제 세포주( PD-L1-/- AGS, PD-L1-/- MKN28)를 면역결핍 마우스에 동소 및 이소 이식한 후 위암조직의 성장과 전이 여부 및 관련 조절 단백질의 발현 정도를 비교분석.
2) PD-L1의 발현이 높은 EBV 양성 위암세포주(SNU719), EBNA1 발현억제 세포주( EBNA1-/- SNU719), PD-L1 발현억제 세포주(PD-L1-/- SNU719)를 각각 면역결핍 마우스에 이식한 후 EBV 양성 위암조직의 성장, 전이 및 관여하는 조절 단백질의 발현 정도를 비교 분석.
3) PD-L1의 발현이 높은 위암세포주(AGS, SNU719)를 면역결핍 마우스에 동소 및 이소 이식한 후 PD-L1 혹은 신호전달 단백질에 대한 저분자 억제제 처리를 통해 위암조직의 성장, 전이, 생존율 분석.