다양한 기능에도 불구하고, 단백질은 본질적으로 제한된 수의 빌딩 블록으로부터 구성된다. 이러한 조성상의 제약은 단백질 연구와 그 실용적 응용에 중대한 도전 과제를 제기한다. 새로운 빌딩 블록을 포함시키기 위해 세포의 단백질 합성 시스템을 전략적으로 조작하는 일은 단백질 연구와 응용에서 이러한 제약을 극복하기 위한 핵심 접근으로 부상해 왔다. 지난 20년 동안, 유전 암호 확장(genetic code expansion, GCE) 분야는 괄목할 만한 발전을 이루었으며, 다양한 생물종에 걸쳐 단백질에 수많은 새로운 기능을 통합할 수 있게 해 주었다. 이러한 기술적 진화는 단백질 영상, 단백질 연구를 위한 프로브의 도입, 단백질-단백질 상호작용의 분석, 단백질 기능의 시공간적 제어, 외부 자극에 의해 유도된 단백질체(proteome) 변화의 탐색, 그리고 새로운 기능을 부여받은 단백질의 합성 등 여러 분야에 걸친 유전 암호 확장의 광범위한 적용을 가능하게 하였다. 본 종합 리뷰에서는 지난 20년 동안 GCE 기술을 활용해 온 세포 및 생물물리학적 응용 전반에 대한 개요를 제공하고자 한다.

세포 내에 어디에나 존재하며 거의 모든 세포 기능에 결정적으로 관여하는 단백질은 생명에 필수적이다. 단백질의 형광 이미징은 원래의 환경에서 단백질의 기능을 이해하는 데 핵심적인데, 이는 살아있는 시스템에서 단백질의 위치, 역학 및 수송 과정을 파악할 수 있는 통찰을 제공하기 때문이다. 이에 따라 형광표지물질로 표적 단백질을 선택적으로 표지하는 일은 생명유기화학, 화학생물학 및 세포생물학을 아우르는 매우 활발한 연구 분야로 부상해 왔다. 세포와 조직에서 단백질을 형광표지물질로 선택적으로 표지하기 위한 다양한 방법이 확립되어 있으며, 단백질을 가시화하고 특성화하기 위해 지속적으로 개발되고 있다. 본 총설은 2018년 이후 보고된 연구 성과를 강조하며, 작은 유기 형광소분자로 세포 단백질을 선택적으로 표지하는 연구와 단백질과 연관된 생물학적 사건을 연구하는 데의 생물학적 적용에 초점을 둔다. 또한 살아있는 시스템에서 각 표지 접근법의 유용성을 기준으로, 각 접근법의 강점과 한계에 대해서도 논의한다.

급진적(라디칼) 지향 단백질 단편화(radical-directed protein fragmentation) 기법, 특히 자유라디칼 개시 펩타이드 서열화(free radical-initiated peptide sequencing, FRIPS) 질량분석(mass spectrometry, MS)은 기체상에서의 단백질 구조 규명에 상당한 잠재력을 제공한다. 본 연구는 FRIPS MS와 유전암호 확장(genetic code expansion, GCE) 기술을 결합하여, 진공(in vacuo)에서 단백질 구조를 분석하기 위한 새로운 접근법을 제시한다. Affibody 단백질 내의 특정 부위에 비자연 아미노산(unnatural amino acids, UAAs)을 도입함으로써, 우리는 여섯 가지 서로 다른 위치에 라디칼 전구체를 효과적으로 삽입하였다. 본 연구는 단백질의 3차 구조 내에서 라디칼 전이가 일어나는 인접성 및 경로를 분석함으로써, 라디칼 지향 단편화로부터 얻어지는 구조 정보를 탐색한다. 그 결과, 최저 전하 상태(+5)에서 Affibody는 원래 구조와 유사한 접힘된(folded) 형태를 유지하였으며, 라디칼 지향 단편화는 ‘through-sequence’ 및 ‘through-space’ 메커니즘 모두를 통해 유의하게 발생함을 확인하였다. 이러한 결과는 FRIPS MS가 기체상에서의 단백질 접힘 및 구조 정보를 잔기(residue) 특이적으로 제공할 가능성을 보여주며, 더 상세한 단백질 구조 분석을 위한 길을 열어준다.

화학적으로 변형된 단백질은 다양한 응용 분야를 갖고 있으나, 기존의 화학선택적(chemo-selective) 방법은 종종 이질적인 표지 생성물을 초래한다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 부위특이적 단백질 표지는 높은 잠재력을 지니며 이 분야에 대한 광범위한 연구를 촉진해 왔다. 그럼에도 불구하고, 기능기들의 복잡성으로 인해 토착(자연) 단백질의 부위특이적 변형은 여전히 어렵다. 따라서 온전한 단백질(intact proteins)을 대상으로 한 부위선택적 표지 방법을 마련하고자 한다. 본 연구에서는 소형 결합 단백질과 유전 암호 확장(genetic code expansion) 기술을 활용하는, 흔적이 남지 않는(Traceless) 친화성 유도 기반의 온전한 단백질 표지에 대한 새로운 접근법을 정립하였다. 이 방법을 적용함으로써, 유방암 세포주를 특이적으로 표적하는 고효능 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugates)를 생성하는 약물 기반의 부위특이적 항체 표지가 가능해졌다. 이 접근법은 제약 응용 분야에서 중요한 장점인, 온전한 표적 단백질의 흔적 없는 접합(traceless conjugation)을 가능하게 한다. 또한 작은 나선형 결합 단백질(small helical binding proteins)은 다양한 표적 단백질에 대해 용이하게 엔지니어링될 수 있으므로, 여러 분야로의 응용 가능성을 확장한다. 본 혁신적 접근은 항체를 포함한 토착 단백질의 부위특이적 변형에서 중요한 진전을 의미하며, 다양한 질환에 대한 치료제 개발을 촉진할 막대한 잠재력도 지닌다.

다양한 기능에도 불구하고, 단백질은 본질적으로 제한된 수의 빌딩 블록으로부터 구성된다. 이러한 조성상의 제약은 단백질 연구와 그 실용적 응용에 중대한 도전 과제를 제기한다. 새로운 빌딩 블록을 포함시키기 위해 세포의 단백질 합성 시스템을 전략적으로 조작하는 일은 단백질 연구와 응용에서 이러한 제약을 극복하기 위한 핵심 접근으로 부상해 왔다. 지난 20년 동안, 유전 암호 확장(genetic code expansion, GCE) 분야는 괄목할 만한 발전을 이루었으며, 다양한 생물종에 걸쳐 단백질에 수많은 새로운 기능을 통합할 수 있게 해 주었다. 이러한 기술적 진화는 단백질 영상, 단백질 연구를 위한 프로브의 도입, 단백질-단백질 상호작용의 분석, 단백질 기능의 시공간적 제어, 외부 자극에 의해 유도된 단백질체(proteome) 변화의 탐색, 그리고 새로운 기능을 부여받은 단백질의 합성 등 여러 분야에 걸친 유전 암호 확장의 광범위한 적용을 가능하게 하였다. 본 종합 리뷰에서는 지난 20년 동안 GCE 기술을 활용해 온 세포 및 생물물리학적 응용 전반에 대한 개요를 제공하고자 한다.

세포 내에 어디에나 존재하며 거의 모든 세포 기능에 결정적으로 관여하는 단백질은 생명에 필수적이다. 단백질의 형광 이미징은 원래의 환경에서 단백질의 기능을 이해하는 데 핵심적인데, 이는 살아있는 시스템에서 단백질의 위치, 역학 및 수송 과정을 파악할 수 있는 통찰을 제공하기 때문이다. 이에 따라 형광표지물질로 표적 단백질을 선택적으로 표지하는 일은 생명유기화학, 화학생물학 및 세포생물학을 아우르는 매우 활발한 연구 분야로 부상해 왔다. 세포와 조직에서 단백질을 형광표지물질로 선택적으로 표지하기 위한 다양한 방법이 확립되어 있으며, 단백질을 가시화하고 특성화하기 위해 지속적으로 개발되고 있다. 본 총설은 2018년 이후 보고된 연구 성과를 강조하며, 작은 유기 형광소분자로 세포 단백질을 선택적으로 표지하는 연구와 단백질과 연관된 생물학적 사건을 연구하는 데의 생물학적 적용에 초점을 둔다. 또한 살아있는 시스템에서 각 표지 접근법의 유용성을 기준으로, 각 접근법의 강점과 한계에 대해서도 논의한다.

급진적(라디칼) 지향 단백질 단편화(radical-directed protein fragmentation) 기법, 특히 자유라디칼 개시 펩타이드 서열화(free radical-initiated peptide sequencing, FRIPS) 질량분석(mass spectrometry, MS)은 기체상에서의 단백질 구조 규명에 상당한 잠재력을 제공한다. 본 연구는 FRIPS MS와 유전암호 확장(genetic code expansion, GCE) 기술을 결합하여, 진공(in vacuo)에서 단백질 구조를 분석하기 위한 새로운 접근법을 제시한다. Affibody 단백질 내의 특정 부위에 비자연 아미노산(unnatural amino acids, UAAs)을 도입함으로써, 우리는 여섯 가지 서로 다른 위치에 라디칼 전구체를 효과적으로 삽입하였다. 본 연구는 단백질의 3차 구조 내에서 라디칼 전이가 일어나는 인접성 및 경로를 분석함으로써, 라디칼 지향 단편화로부터 얻어지는 구조 정보를 탐색한다. 그 결과, 최저 전하 상태(+5)에서 Affibody는 원래 구조와 유사한 접힘된(folded) 형태를 유지하였으며, 라디칼 지향 단편화는 ‘through-sequence’ 및 ‘through-space’ 메커니즘 모두를 통해 유의하게 발생함을 확인하였다. 이러한 결과는 FRIPS MS가 기체상에서의 단백질 접힘 및 구조 정보를 잔기(residue) 특이적으로 제공할 가능성을 보여주며, 더 상세한 단백질 구조 분석을 위한 길을 열어준다.

화학적으로 변형된 단백질은 다양한 응용 분야를 갖고 있으나, 기존의 화학선택적(chemo-selective) 방법은 종종 이질적인 표지 생성물을 초래한다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 부위특이적 단백질 표지는 높은 잠재력을 지니며 이 분야에 대한 광범위한 연구를 촉진해 왔다. 그럼에도 불구하고, 기능기들의 복잡성으로 인해 토착(자연) 단백질의 부위특이적 변형은 여전히 어렵다. 따라서 온전한 단백질(intact proteins)을 대상으로 한 부위선택적 표지 방법을 마련하고자 한다. 본 연구에서는 소형 결합 단백질과 유전 암호 확장(genetic code expansion) 기술을 활용하는, 흔적이 남지 않는(Traceless) 친화성 유도 기반의 온전한 단백질 표지에 대한 새로운 접근법을 정립하였다. 이 방법을 적용함으로써, 유방암 세포주를 특이적으로 표적하는 고효능 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugates)를 생성하는 약물 기반의 부위특이적 항체 표지가 가능해졌다. 이 접근법은 제약 응용 분야에서 중요한 장점인, 온전한 표적 단백질의 흔적 없는 접합(traceless conjugation)을 가능하게 한다. 또한 작은 나선형 결합 단백질(small helical binding proteins)은 다양한 표적 단백질에 대해 용이하게 엔지니어링될 수 있으므로, 여러 분야로의 응용 가능성을 확장한다. 본 혁신적 접근은 항체를 포함한 토착 단백질의 부위특이적 변형에서 중요한 진전을 의미하며, 다양한 질환에 대한 치료제 개발을 촉진할 막대한 잠재력도 지닌다.

BPAs가 두 개 포함된 단백질과의 복합체 형성을 위해 사용되었으며, 선형 복합체가 형성되었다. 본 보고서에서 제안한 방법은 기술적으로 단순하며, 흥미로운 기능을 지닌 다양한 단백질에 전반적으로 적용 가능하다. 따라서 이 방법은 기능성 단백질 조립체의 설계 및 구축에 유용할 것이다.

상피세포성장인자 수용체(EGFR)는 주로 세포 증식에 관여하는 세포 표면 당단백질이다. 이러한 수용체의 과발현은 광범위한 종양의 발생과 밀접하게 관련되어 있다. 또한 EGFR에 결합된 당(glycans)은 EGF에 의한 활성화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. EGFR의 병태생리학적 중요성 때문에, 우리는 유전암호 확장(genetic code expansion) 기법과 생체정합적(bioorthogonal) 화학을 이용하여 세포 표면에 형광 표지된 EGFR(EGFR128-AZDye 488)을 제작하였다. EGFR128-AZDye 488은 처음에 생존 세포에서 EGFR의 시간 의존적 내포(endocytosis)를 조사하는 데 활용되었다. 그 결과, EGFR 억제제 및 항체는 EGF에 의해 촉진되는 EGFR 내포를 억제하는 것으로 나타났으며, EGFR의 당을 인식하는 렉틴은 세포로의 EGFR 내재화를 증가시키지 않았다. EGFR이 세포에 유입되는 과정에서 부착된 당이 미치는 영향을 다룬 연구에서 관찰된 바에 따르면, 탈시알화(de-sialylated) 또는 탈푸코실화(de-fucosylated)된 EGFR은 야생형 EGFR보다 더 효율적으로 세포 내로 내재화된다. 또한 AZDye 488이 결합된 EGFR( FRET 공여자)과 로다민으로 표지된 세포 당( FRET 수용자)을 포함하는 세포에서의 FRET 기반 이미징 방법을 사용하여, EGFR에 부착된 시알산 잔기가 생세포 표면에서 특이적으로 검출되었다. 종합하면, 본 연구 결과는 형광 표지된 EGFR이 EGFR의 세포 기능을 이해하기 위한 연구에서 유용한 도구가 될 수 있음을 시사한다.

결합 효소 시스템에서 RgDAAO는 UAAs의 d-형을 입체특이적으로 산화하여 해당 α-케토산을 생성하며, 이어서 TtAT가 이를 UAAs의 l-형으로 전환함으로써 라세믹 UAA를 정량적이고 입체특이적으로 광학적으로 순수한 형태로 전환한다. 광학적으로 순수한 UAA를 표적 단백질에 유전적으로 통합한 경우, 동일한 실험을 UAA의 라세믹 혼합물로 수행했을 때보다 단백질 수율이 더 높았다. 본 방법은 라세믹 혼합물로부터 광학적으로 순수한 UAAs를 제조하는 데뿐만 아니라, 두 효소 모두의 광범위한 기질 특이성을 바탕으로 구조적으로 다양한 UAAs로의 확장도 가능할 것이다.