1. ELP-타겟단백질에 의한 파트너단백질 분리 방법 개발 융합단백질 상태에서도 온도나 염농도에 따라 가역적인 불용성 상태가 유도되는 ELP (Elastin-Like Polypeptide)의 특성을 정제 방법으로 활용함. 온도나 염 농도를 조절하여 ELP를 수용성에서 불용성으로 전이시킴. 이 전이는 가역적이기 때문에 온도를 낮추면 융합단백질을 재활용할 수 있음. 타겟-ELP의 융합단백질과 파트너단백질을 혼합한 후, 전이온도 이상에서 고체상으로 응집시키면, 파트너단백질도 같이 고체상으로 침전시킬 수 있다고 예상함. GST pulldown에서 사용하는 bead가 macroscopic하다면, 본 방법의 응집체는 nanoscale이라 할 수 있으며, 따라서 적은 양의 융합단백질로도 파트너단백질을 추출해 낼 수 있고, 정제 과정도 GST pulldown보다 훨씬 단순화되어 파트너단백질의 손실 또한 줄일 수 있을 것으로 예상함. 본연구실에서 구축한 벡터를 사용하여, 타겟단백질과 ELP를 융합하는데 필요한 플라즈미드를 손쉽게 제조할 수 있으며, 이는 제안된 연구를 원활히 진행시킬 수 있을 것으로 판단됨. 2. 응집체 형성/분리에 따른 NMR 신호의 소멸/재생의 관찰을 통한 단백질-단백질 상호작용 확인 방법 개발 NMR 분광학의 본질적 특성에 따라, 관찰 대상의 크기가 매우 커지면 NMR 신호가 소멸하기 때문에, 파트너단백질이 응집체를 형성한 타겟단백질과 결합한 상태라면, 파트너단백질의 신호는 소멸될 것으로 예상함. 상호작용을 저해할 수 있는 일반적인 이온화합물이나, 상호작용 자체를 저해하는 특이적인 물질을 혼합하면, 파트너단백질이 분리되어 수용성 상태로 전이되고, 이에 따라 분자량이 원래대로 회복되면, NMR 신호 또한 재생될 것으로 예상함. 이러한 신호의 소멸/재생은 가역적이고, 1차원 NMR로도 관찰이 가능하지만, N-15으로 레이블된 단백질을 활용하면 2차원 HSQC로 훨씬 민감하게 확인할 수 있음. 3. 상호작용 저해 리간드에 의한 타겟-파트너의 분리를 활용한 저해제 확인 방법 개발 타겟-파트너가 전이온도 이상에서 응집체를 형성하면, 두 단백질의 NMR 신호가 사라지는데, 이 상호작용을 방해하는 리간드 또는 저해제를 혼합하면, 타겟단백질은 고체상으로 남아있으나, 파트너단백질은 분리되어 수용액 상태로 전이되고, 이에 따라 분자량이 원래대로 회복되면, NMR 신호가 재생될 것으로 예상함. 따라서, NMR 신호를 재생시키는 화합물이 타겟-파트너 상호작용의 저해제라고 할 수 있으며, 이 방법에는 경쟁적 또는 비경쟁적 메커니즘을 통하게 됨. 저해제의 존재여부는 다수의 저분자 화합물을 한 번에 투입하고 NMR 신호의 재생을 관찰함으로써 가능함. 저분자 화합물의 혼합물은 C-13으로 레이블된 대장균 대사체를 사용하여 2차원 HSQC를 통해 관찰함. 저해제가 타겟 뿐만 아니라 파트너에도 동일한 메커니즘으로 결합할 수 있는데, 어느 단백질에 결합했는지도 본연구실에서 이전 연구를 통해 확립한 방법으로 규명이 가능함.

1. 타겟단백질의 가역적 응집체 형성 ● 타겟단백질과 결합하는 파트너단백질을 응집체 형성을 통해 추출해 냄. ● NaCl과 같은 염을 고농도로 가하면 파트너단백질은 분리되고 타겟단백질은 응집체로 남아있게 됨. 2. 파트너단백질의 결합 확인 ● 타겟단백질과 파트너단백질을 혼합하고 전이온도 이상에서 침전물을 분리함. ● NMR 버퍼에 녹인 후, 온도를 변화시키며 NMR 신호 소멸/생성을 확인함. 3. 저해리간드의 탐색 및 확인 ● 타겟단백질과 파트너단백질을 결합시키고 응집체를 형성시킴. ● 리간드 라이브러리 (대사체)를 혼합시켜 파트너단백질의 분리를 확인함. ● NMR을 사용하여 단백질 신호가 재생됨을 확인함. ● NMR을 사용하여 리간드를 확인하고 검증함.