◆ 아토피 피부염 동물모델을 이용한 in vivo 실험 1. 아토피 피부염 동물모델: DNCB을 이용한 면역감작과 귀에 도포를 통한 피부염 모델 - 림프절의 크기를 측정하여 염증정도를 확인하고, FFA4 효능제인 compound A와 S1P2의 길항제인 JTE-013에 의한 억제를 확인 - 림프절에서 분리한 mRNA를 사용하여 Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포의 사이토카인을 RT-PCR을 통해 확인 - H&E 염색법과 Toluidine Blue O 염색법을 통해 귀 조직에서 귀 두께의 변화, 비만세포를 포함한 면역 세포의 축적을 확인 - 혈청에서 ELISA를 통해 IgE를 측정하여 비교 - 림프절에서 CD4+ FoxP3+ Treg의 증가를 유동 세포 분석법으로 확인 ◆ 유전자 결손 BALB/c 마우스의 활용 1. FFA4 유전자 결손 마우스: BALB/c background의 FFA4 결손 마우스를 자체 제작하였으며, FFA4 유전자 결손 마우스에서 아토피 피부염 연구를 통하여 FFA4의 기능을 확인 2. S1P2 유전자 결손 마우스: BALB/c background의 S1P2 결손 마우스를 자체 제작하였으며, S1P2 유전자 결손 마우스에서 아토피 피부염 연구를 통하여 FFA4의 기능을 확인 ◆ 수지상세포, T 세포, 비만세포를 이용한 in vitro 실험 1. 수지상 세포와 T 세포의 공생배양을 통한 기능연구 - T 세포와 수지상세포를 공생배양한 후, DNCB와 Compound A 또는 JTE-013를 각각 처리하여 유동 세포 분석법을 이용해 Treg 세포의 변화를 관찰 - FFA4와 S1P2 유전자 결손 마우스 (KO)로부터 분리한 수지상세포와 T 세포를 사용하여 FFA4 또는 S1P2에 의해 Treg 세포의 수가 변화하는지 확인 - Treg 세포에서 중요한 사이토카인인 IL-10과 TGF-β의 변화를 ELISA를 통하여 측정 2. 수지상 세포와 비만세포에서 기능 연구 - 골수 유래 수지상 세포의 maturation과 migration 과정에서 FFA4 효능제와 S1P2 길항제의 영향 연구 - FFA4와 S1P2 유전자 결손 마우스 (KO)로부터 분리한 수지상세포를 사용하여 maturation과 migration의 변화 연구 - 골수 유래 비만세포에서 Compound A와 AH7614를 농도별로 처리하여 β-hexosaminidase assay를 통하여 탈과립 정도를 측정 - FFA4와 S1P2 유전자 결손 마우스로 (KO)부터 분리한 비만세포를 이용하여 FFA4를 통한 Compound A와 JTE-013의 항알러지 효과를 관찰한다. ◆ TGF-α shedding assay를 활용 1. 새로운 FFA4의 효능제와 S1P2의 길항제 후보물질 탐색 - FFA4와 S1P2에 각각 높은 친화력을 가진 리간드를 찾기 위해 천연물로부터 분리한 물질과 제공받은 합성물질을 TGF-α shedding assay를 활용하여 기존의 효능제 또는 길항제와 비교하여 후보물질 발굴 - 이 후 docking study를 통해 FFA4, S1P2와 후보물질의 적합성 판단