먼저 중간엽 줄기세포인 지방유래 줄기세포로 부터 엑소좀을 분리한 후 창상 치유 효능, 염증 완화 효능, 흉터 완화 효능을 검증한다. 이 과정에서 지속적인 연구를 위한 세포 모델 (인체섬유아세포 모델, 근섬유아세포 분화 모델, 대식세포 모델 등) 및 동물 모델(쥐 창상 모델, 쥐 화상 모델, 인체 흉터 모델)을 확립한다. 일차적으로 효능이 검증되면 그 효능 증대 방안으로 miRNA, siRNA, 단백질등을 엑소좀에 포함시켜 상기 모델에 적용하여 그 효과를 확인한다. 마지막으로 레이저 박피와 병용하는 방법으로 피부 직접투여 방식의 효능 극대화를 시도한다. 단계적으로 기술하면 아래와 같다. - 인체 유래 지방 줄기 세포에서 추출한 엑소좀(이하 hASC-Exo)의 추출 및 특성 확인 : 엑소좀 추출 키트를 이용해 지방유래 줄기세포에서 엑소좀을 추출하고 그 성상을 분석 - hASC-Exo의 창상 치유 촉진 효과 확인 (인체섬유아세포 모델, 생쥐 창상 모델 사용) : 인체섬유아세포를 인체 진피로 부터 분리, 배양하고 생쥐 등에 전층 피부 결손을 생성하여 실험 모델을 만든다 : 모델에 hASC-Exo를 투여하고 Collagen, α-smooth muscle actin 합성 정도 및 창상의 치유 정도 등을 조사함 - hASC-Exo의 염증 완화 효과 확인 (생쥐 대식세포 모델, 쥐 화상 모델 사용) : 생쥐 RAW264.7 대식세포를 일반 배지, hASC-Exo 배양 배지, PBS에 6시간동안 공동 배양한 후 LPS(lipopolysaccharide)로 처치하고 염증관련 세포분비물질 등을 분석한다 : 쥐 등부위에 화상을 입히고 hASC-Exo를 주입한 후 혈액 및 조직에서 염증관련 인자의 발현을 확인한다 - hASC-Exo의 흉터에 대한 완화 효과 확인 (근섬유아세포 분화모델, 인체흉터 동물모델) : TGF-β로 섬유아세포를 자극하여 근섬유아세포(Myofibroblast)로 분화를 유도하는 모델을 제작 하고 hASC-Exo를 주입한 후 α-SMA 및 Collagen Type I 발현정도를 확인함 : 인체피부조직을 생쥐 등에 이식하여 인체 흉터 모델을 제작하고 hASC-Exo를 주입하고 조직을 채취하여 육안 검사 및 α-SMA과 Collagen Type I의 발현을 확인 함 - hASC-Exo의 흉터 완화 효과 향상을 위한 유전물질 및 펩타이드의 주입 : 근섬유아세포 생성에 핵심적인 TGF-β/SMAD2 pathway를 타겟으로 하는 miRNA를 지방줄기세포에 transfection시키고 이 세포로부터 엑소점을 얻음 : TGF-βreceptor를 억제하는 siRNA를 전기천공법을 통해 hASC-Exo에 직접 주입 : 대식세포의 이동을 저해하는 CXCR-4 길항제를 hASC-Exo에 단순 노출시켜 주입 : 위에서 제작한 miRNA, siRNA, CXCR-4길항제를 포함하는 엑소좀을 상기 세포, 동물 모델에 사용하여 그 효능을 검증 - hASC-Exo의 피부 침투 효과 증진을 위한 분획성 이산화탄소 레이저의 사용 : 배양한 피부를 대상으로 10,600nm 파장의 분획성 CO2레이저를 이용하여 피부 일부를 박피하고 기본 적인 hASC-Exo 및 기능 강화된 hASC-Exo를 투여하여 그 기능 향상 효과를 검증