(1) 1차년도(2021) - 질병 코호트 구축과 전장엑솜분석(Whole Exom Sequencing) - IRB 승인 - 구강방사선 및 임상검사를 통해 정확한 질병 표현형을 확인 가능한 법랑질형성부전 환자군 30명을 진단 및 모집하여 연구를 위한 코호트를 구축. - 타액 샘플 채취: ORAgene kit(OG-500)를 통해 법랑질 형성부전증 환자의 타액으로 DNA 샘플을 얻음. - 엑솜 염기서열을 분석은 3 ug의 genomic DNA에서 엑솜 분리 키트를 사용하여 전체 유전체 중 단백질을 코딩하는 엑손 부위만을 선별적으로 분리. - 분리된 DNA 조각들을 SOLiD 차세대 염기서열 분석기를 이용하여 대량의 염기서열을 분석. - 분석된 염기서열은 인간의 표준 염기서열과 비교하여 유전변이형의 종류와 빈도를 조사. - 1,000 게놈 프로젝트 데이터베이스를 통해 본 연구의 WES 결과를 비교하고 질병관리본부의 안산 코호트와 본 연구의 WES 결과를 비교분석하여 후보 유전자 수를 줄여나가는 방향으로 연구를 진행. (2) 2차년도(2022) - 생물 정보학(Bioinformatics); Gene Set Enrichment Analysis 분석 - WES 에서 얻은 초기 결과를 annotation을 통해 줄인 후보 유전자 변이 군을 대상으로 기능적 유전자군을 밝히기 위해 GSEA 를 시행 - 후보 유전자군의 모든 유전자들의 발현 패턴에 대해 순위(rank)를 매겨서 정렬한 후, 지정된 gene set에 포함되어 있는 모든 유전자들이 특정 영역에 몰려서 나타날 확률이 어느 정도인지를 Kolmogorov-Smirnov statistic 을 이용하여 계산함. - GSEA는 정의된 유전자 군에서 통계적으로 상관성 있는 발현 양상을 보이는 유전자들은 서로 군집화 되며 그렇지 않은 유전자들은 멀리 떨어지게 되는데, GSEA는 이렇게 군집화되어 해당 생물학적인 현상(pathway, GO 등)을 가장 잘 대표할 수 있는 유전자들(leading edge subset)을 선별해 줌. - 진단모듈을 만들기 위해 GSEA로 후보 유전자 변이형을 기능적 유전자 군으로 나누는 병리학적 의미는 세포 내에서 생물학적 기능이 수행되는 단위는 개별 gene이 아니라 group of genes (module)임을 착안 함. - 서로 다른 gene에서 발견된 genetic mutation이라고 하더라도 변이가 생긴 유전자들이 같은 pathway에 속하거나 같은 기능을 하는 protein complex에 속해 있다면, 두 mutation 모두 같은 질환에 영향을 미칠 수 있음. - 서로 다른 gene 사이의 관계를 생물학적 network 차원에서 분석하면, 그 질병과 관계있는 생물학적 모듈 (biological pathway)을 찾을 수 있음. - 이러한 모듈을 기반으로 하는 진단 모듈을 만들면 환자마다 다를 수 있는 유전변이 결과를 넘어서 유전자 수준의 변이를 통한 생물학적 지표 기반 진단 모듈을 넘어선 기능적으로 연관된 유전자군 기반 진단모듈로서의 역할을 기대 할 수 있는 정밀의학이 가능. - 3차년도 검증을 위한 30명의 환자군 모집 (3) 3차년도(2023) - 진단 모듈 검증 - 1차년도와 다른 2년차에 모집한 독립된 코호트 30명의 환자군에서 DNA 샘플 분석과 생물정보학적 분석을 시행 독립적인 환자 그룹을 통해 바이오 마커의 재현성 검증 및 질병 연관성 분석의 정밀성 확보 - 두 개의 다른 코호트에서 얻은 후보 유전자군을 비교분석 특히 GSEA를 통해 공통적으로 묶이는 기능적 유전자군을 기반으로 모듈을 생성할 수 있음. 단일 유전자 비교와 모듈기반 바이오 마커 그룹의 비교 분석을 통한 검증 – 독립적으로 얻은 코호트 군에서 3차년도까지 연구를 통해 개발한 모듈상의 유전자 변이형과 대조함을 통해서 법랑질 형성부전 바이오 마커 유용성 최종검증.

(1) 1차년도(2021) - 질병 코호트 구축과 전장엑솜분석(Whole Exom Sequencing) - IRB 승인 - 구강방사선 및 임상검사를 통해 정확한 질병 표현형을 확인 가능한 법랑질형성부전 환자군 30명을 진단 및 모집하여 연구를 위한 코호트를 구축. - 타액 샘플 채취: ORAgene kit(OG-500)를 통해 법랑질 형성부전증 환자의 타액으로 DNA 샘플을 얻음. - 엑솜 염기서열을 분석은 3 ug의 genomic DNA에서 엑솜 분리 키트를 사용하여 전체 유전체 중 단백질을 코딩하는 엑손 부위만을 선별적으로 분리. - 분리된 DNA 조각들을 SOLiD 차세대 염기서열 분석기를 이용하여 대량의 염기서열을 분석. - 분석된 염기서열은 인간의 표준 염기서열과 비교하여 유전변이형의 종류와 빈도를 조사. - 1,000 게놈 프로젝트 데이터베이스를 통해 본 연구의 WES 결과를 비교하고 질병관리본부의 안산 코호트와 본 연구의 WES 결과를 비교분석하여 후보 유전자 수를 줄여나가는 방향으로 연구를 진행. (2) 2차년도(2022) - 생물 정보학(Bioinformatics); Gene Set Enrichment Analysis 분석 - WES 에서 얻은 초기 결과를 annotation을 통해 줄인 후보 유전자 변이 군을 대상으로 기능적 유전자군을 밝히기 위해 GSEA 를 시행 - 후보 유전자군의 모든 유전자들의 발현 패턴에 대해 순위(rank)를 매겨서 정렬한 후, 지정된 gene set에 포함되어 있는 모든 유전자들이 특정 영역에 몰려서 나타날 확률이 어느 정도인지를 Kolmogorov-Smirnov statistic 을 이용하여 계산함. - GSEA는 정의된 유전자 군에서 통계적으로 상관성 있는 발현 양상을 보이는 유전자들은 서로 군집화 되며 그렇지 않은 유전자들은 멀리 떨어지게 되는데, GSEA는 이렇게 군집화되어 해당 생물학적인 현상(pathway, GO 등)을 가장 잘 대표할 수 있는 유전자들(leading edge subset)을 선별해 줌. - 진단모듈을 만들기 위해 GSEA로 후보 유전자 변이형을 기능적 유전자 군으로 나누는 병리학적 의미는 세포 내에서 생물학적 기능이 수행되는 단위는 개별 gene이 아니라 group of genes (module)임을 착안 함. - 서로 다른 gene에서 발견된 genetic mutation이라고 하더라도 변이가 생긴 유전자들이 같은 pathway에 속하거나 같은 기능을 하는 protein complex에 속해 있다면, 두 mutation 모두 같은 질환에 영향을 미칠 수 있음. - 서로 다른 gene 사이의 관계를 생물학적 network 차원에서 분석하면, 그 질병과 관계있는 생물학적 모듈 (biological pathway)을 찾을 수 있음. - 이러한 모듈을 기반으로 하는 진단 모듈을 만들면 환자마다 다를 수 있는 유전변이 결과를 넘어서 유전자 수준의 변이를 통한 생물학적 지표 기반 진단 모듈을 넘어선 기능적으로 연관된 유전자군 기반 진단모듈로서의 역할을 기대 할 수 있는 정밀의학이 가능. - 3차년도 검증을 위한 30명의 환자군 모집 (3) 3차년도(2023) - 진단 모듈 검증 - 1차년도와 다른 2년차에 모집한 독립된 코호트 30명의 환자군에서 DNA 샘플 분석과 생물정보학적 분석을 시행 독립적인 환자 그룹을 통해 바이오 마커의 재현성 검증 및 질병 연관성 분석의 정밀성 확보 - 두 개의 다른 코호트에서 얻은 후보 유전자군을 비교분석 특히 GSEA를 통해 공통적으로 묶이는 기능적 유전자군을 기반으로 모듈을 생성할 수 있음. 단일 유전자 비교와 모듈기반 바이오 마커 그룹의 비교 분석을 통한 검증 – 독립적으로 얻은 코호트 군에서 3차년도까지 연구를 통해 개발한 모듈상의 유전자 변이형과 대조함을 통해서 법랑질 형성부전 바이오 마커 유용성 최종검증.

본 과제는 구강 방사선과 임상검사를 통해 정중과잉치 환자군을 모으고, 타액 DNA로 유전정보를 분석해 발생 가능성을 예측하는 정밀의학 진단 모듈 개발 연구임. 연구목표는 Whole Exome Sequencing로 정중과잉치 유발 후보 유전자 변이형을 검출하고, GSEA, PPI, Gene co-occurrence analysis 등 생물정보학으로 치아발생 관련 기능적 유전자군과 발병 경로를 규명한 뒤, 한국인 칩 array로 한국인에서의 변이 발현 빈도 지표를 구축해 환자 유형별 위험도를 분류하는 체계를 만드는 데 있음. 기대효과는 조기진단과 맞춤 치료 기반 마련을 통해 불필요한 치료비용 감소 및 치과 유전 연구 확장임.

본 연구는 구강 방사선과 임상 검사로 정중과잉치 환자를 찾고, 환자 타액 DNA를 Whole Exome Sequencing(WES)해 유전적 원인 후보 변이형을 검출하는 정밀의학 연구임. 연구 목표는 유전변이형 정보를 바탕으로 GSEA, Gene co-occurrence analysis(R package vegan permatswap) 등 생물정보학으로 치아발생에 영향을 주는 기능적인 유전자군과 생물학적 경로·기전을 밝히는 데 있음. 이후 3차년도 한국인칩으로 특이 변이를 선별해 조기 진단 및 정밀의학용 질병지표 모듈을 개발하는 기대효과가 있음.