본 연구는 헴 생산을 위한 효율적인 Saccharomyces cerevisiae 기반 세포 공장을 개발하고자 하였다. 미국 위스키 생산에 사용되는 종균(starting strain)인 산업 균주 S. cerevisiae KCCM 12638을 자연적으로 높은 헴 농도를 지니고 있기에 선정하였으며, 배지 조성을 최적화하였다. 이어서 CRISPR/Cas9 기반 유전체 편집을 적용하여 헴 생합성 경로로의 탄소 흐름을 증진시키기 위해 헴 합성에 관여하는 핵심 효소를 암호화하는 HEM2, HEM3, HEM12 및 HEM13 유전자를 과발현하였다. 또한 헴 분해를 방지하기 위해 헴 산소화효소 1(heme oxygenase 1)을 암호화하는 HMX1 유전자를 불활성화하였다. 그 결과 ΔHMX1_H2/3/12/13 균주는 배치 발효에서 9 mg/L의 헴 티터를 달성하였으며, 이는 야생형 KCCM 12638 균주 대비 1.7배 향상된 수치이다. 포도당 제한 조건의 유가증식(fed-batch) 발효에서는 ΔHMX1_H2/3/12/13 귀이 67 mg/L의 헴을 생산하였다. 본 연구는 산업용 효모 균주의 유전공학적 개질을 통해 헴 생산을 유의미하게 증대시킬 수 있음을 보여주며, 식품, 제약 및 바이오에너지 분야에서의 유망한 응용 가능성을 시사한다.

균주.

본 연구는 헴 생산을 위한 효율적인 Saccharomyces cerevisiae 기반 세포 공장을 개발하고자 하였다. 미국 위스키 생산에 사용되는 종균(starting strain)인 산업 균주 S. cerevisiae KCCM 12638을 자연적으로 높은 헴 농도를 지니고 있기에 선정하였으며, 배지 조성을 최적화하였다. 이어서 CRISPR/Cas9 기반 유전체 편집을 적용하여 헴 생합성 경로로의 탄소 흐름을 증진시키기 위해 헴 합성에 관여하는 핵심 효소를 암호화하는 HEM2, HEM3, HEM12 및 HEM13 유전자를 과발현하였다. 또한 헴 분해를 방지하기 위해 헴 산소화효소 1(heme oxygenase 1)을 암호화하는 HMX1 유전자를 불활성화하였다. 그 결과 ΔHMX1_H2/3/12/13 균주는 배치 발효에서 9 mg/L의 헴 티터를 달성하였으며, 이는 야생형 KCCM 12638 균주 대비 1.7배 향상된 수치이다. 포도당 제한 조건의 유가증식(fed-batch) 발효에서는 ΔHMX1_H2/3/12/13 귀이 67 mg/L의 헴을 생산하였다. 본 연구는 산업용 효모 균주의 유전공학적 개질을 통해 헴 생산을 유의미하게 증대시킬 수 있음을 보여주며, 식품, 제약 및 바이오에너지 분야에서의 유망한 응용 가능성을 시사한다.

균주.

KACC 48331은 높은 글루타티온 생산성을 근거로 선정되었다. 아크롤레인 저항성 스크리닝을 통해 글루타티온 함량이 유의하게 더 높은 #14 변이를 분리하였다. 최적 배치 발효 조건은 당밀과 옥수수 침지액(CSL)이라는 비용 효율적인 배지를 사용하여 20 °C 및 pH 4.5에서 확립되었다. 연속 배치(fed-batch) 발효에서 #14 변이는 탄소 및 질소 공급원으로 당밀과 CSL을 사용하여 1.98 g/L의 글루타티온을 달성했으며, 이는 펩톤과 효모추출물을 포함한 값비싼 복합 배지에서 얻는 수율과 견줄 만한 수준이었다. 특히 생성된 글루타티온의 99% 이상이 환원된 형태이며, 생물학적으로 활성인 형태로 존재하였다. 이러한 결과는 비GMO 효모와 산업 부산물을 활용하여 지속 가능하고 경제적인 글루타티온 생산이 가능함을 보여준다. 부록 정보: 온라인 버전에는 10.1007/s10068-025-01995-9에서 이용 가능한 부가 자료가 포함되어 있다.

Saccharomyces boulardii는 장내 염증을 완화할 수 있는 프로바이오틱스이다. 본 연구에서는 인간 종양괴사인자 α에 대한 모델 항염증 단백질로서 서로 다른 두 가지 단일 사슬 가변 조각(single-chain variable fragments, scFv)을 활용하여 새로운 표면 발현(표면 디스플레이) 시스템을 개발하였다. 먼저 CRISPR/Cas9 기반 유전체 편집 시스템을 사용하여 발현 카세트를 S. boulardii의 염색체에 통합하고, 강한 구성적 프로모터를 선택함으로써 scFv의 발현 수준을 최적화하였다. 표적 단백질의 디스플레이 효율에 있어 신호펩타이드와 앵커링 모티프가 핵심 요인이므로, 다음으로 S. boulardii에서 효율적인 표면 디스플레이 시스템을 개발하기 위한 이들의 최적 조합을 찾고자 하였다. 다양한 신호펩타이드 및 앵커링 모티프 조합 가운데, 신호펩타이드와 앵커링 모티프로 각각 SED1 신호펩타이드 및 Saccharomyces cerevisiae에서 유래한 DAN4 당지질포스파티딜이노시톨(glycophosphatidylinositol) 도메인을 사용하여 scFv를 발현하도록 설계된 S. boulardii가 가장 높은 디스플레이 효율을 보였다. 마지막으로, 낮은 질병 활성 지수(disease activity index) 점수, 결장 단축의 예방, 그리고 친염증성 사이토카인의 감소를 포함하여 scFv의 높은 생산량을 보이는 발현 균주들의 항염증 효과를 대장염 마우스 모델을 사용하여 검증하였다. 따라서, 본 연구의 접근법은 다른 유용한 단백질을 발현하는 엔지니어드 S. boulardii 개발 분야에서 잠재적인 응용 가능성이 있다고 생각한다.

글루타티온은 다양한 건강 증진 효과를 갖는 중요한 삼펩타이드이다. 현재 글루타티온은 다량의 글루타티온을 함유하는 효모인 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 발효 공정을 통해 산업적으로 생산되고 있다. 그러나 글루타티온 생산 수율과 역가는 숙주 균주로 세균을 사용하는 경우에 비해 상대적으로 낮다. 이러한 제한의 근본적인 이유는 기존 연구들이 주로 글루타티온 생산과 직접적으로 연관된 유전자 표적에 집중해 왔기 때문이다. 이 한계를 극복하기 위해 본 연구는 S. cerevisiae에서 글루타티온 생산을 향상시킬 수 있는 새로운 유전자 표적을 규명하고자 하였다. 이를 위해, 아크롤레인 저항성 매개 선별을 두 차례 수행한 후 야생형 D452-2 균주에 비해 글루타티온 함량이 1.8배 더 높은 #ACR3-12 돌연변이를 분리하였다. 다음으로, #ACR3-12 돌연변이에서 발생한 돌연변이를 분석하여 증가된 글루타티온 생산을 담당하는 유전자를 확인하였다. 특히 세포벽 단백질 합성의 번역 억제 인자를 암호화하는 SSD1과, Ty2 레트로트랜스포존을 암호화하는 YBL100W-B 유전자가 글루타티온 생산 효율을 향상시키는 데 핵심적인 역할을 수행하였다. 구체적으로, YBL100W-B 유전자를 과발현하는 D452-2 균주는 야생형 D452-2 균주에 비해 최대 건조 세포 중량과 글루타티온 농도가 각각 1.6배 및 2.1배 더 높았다.