이 글은 화학 및 기계공학과 공학경영 분야 학생들을 위한 (1) 학부/대학원 공동 과정과 (2) 공정 데이터 분석을 위한 학부 화학공학 전공(집중)에서의 경험을 포함하여, 공정 데이터 분석 및 머신러닝을 교육하는 과정에 대해 기술한다. 또한 화학공학도에게 데이터 과학을 교육하는 데 있어 발생하는 어려움과 이를 극복하기 위한 전략을 설명한다.

배치 저pH(저산도) 유지(batch low-pH hold)는 포유류 유래 생물학적 제제로부터 생산되는 제제에서 외피(enveloped) 바이러스를 불활성화하기 위한 일반적인 공정 단계이다. 생물의약품 제조의 배치 공정에서 연속 공정으로의 전환에 대한 관심이 증가함에 따라, 배치 저pH 유지 공정을 연속 공정에 적용하려는 시도가 다수 이루어졌다. 그러나 이 시스템의 운전과 관련된 제어(컨트롤)상의 어려움은 직접적으로 다루어지지 않았다. 본 논문은 시중에서 구할 수 있는 부품으로 구성한 저비용의 컬럼 기반 연속 바이러스 불활성화 시스템을 제시한다. 비선형성 및 운전 변동을 반영하기 위해 베이지안 추정을 활용하는 반응 불변(reaction-invariant) pH 제어기가 모델 기반으로 구현된다. 체류시간 분포(residence time distribution)는 축방향 분산이 연속 교반 탱크 반응기(continuous stirred tank reactor)와 직렬로 연결된 플러그 플로우 반응기(plug flow reactor)로 모델링되며, 역추적자(inverse tracer) 실험을 통해 운전 중 주기적으로 추정된다. 추정된 체류시간 분포는 최소 체류시간(minimum residence time)을 정량화하며, 이는 공급 유량을 조정하는 데 사용된다. 제어기 검증 실험은 pH 및 최소 체류시간 설정값 추종(setpoint tracking)과 교란(disturbance) 억제가 빠르고 정확한 응답과 함께 달성되며 불안정성이 없음을 보여준다. 바이러스 불활성화 시험 결과는 연장된 운전 기간 동안 로그 감소값(logarithmic reduction values)이 엄격하게 제어됨을 입증한다. 본 연구는 생산성을 높이고 제품 품질을 개선하며 환자 안전을 강화한다는 목적에 기여하는 연속 바이러스 불활성화 시스템의 설계 및 운전에 필요한 도구를 제공한다.

이 글은 화학 및 기계공학과 공학경영 분야 학생들을 위한 (1) 학부/대학원 공동 과정과 (2) 공정 데이터 분석을 위한 학부 화학공학 전공(집중)에서의 경험을 포함하여, 공정 데이터 분석 및 머신러닝을 교육하는 과정에 대해 기술한다. 또한 화학공학도에게 데이터 과학을 교육하는 데 있어 발생하는 어려움과 이를 극복하기 위한 전략을 설명한다.

배치 저pH(저산도) 유지(batch low-pH hold)는 포유류 유래 생물학적 제제로부터 생산되는 제제에서 외피(enveloped) 바이러스를 불활성화하기 위한 일반적인 공정 단계이다. 생물의약품 제조의 배치 공정에서 연속 공정으로의 전환에 대한 관심이 증가함에 따라, 배치 저pH 유지 공정을 연속 공정에 적용하려는 시도가 다수 이루어졌다. 그러나 이 시스템의 운전과 관련된 제어(컨트롤)상의 어려움은 직접적으로 다루어지지 않았다. 본 논문은 시중에서 구할 수 있는 부품으로 구성한 저비용의 컬럼 기반 연속 바이러스 불활성화 시스템을 제시한다. 비선형성 및 운전 변동을 반영하기 위해 베이지안 추정을 활용하는 반응 불변(reaction-invariant) pH 제어기가 모델 기반으로 구현된다. 체류시간 분포(residence time distribution)는 축방향 분산이 연속 교반 탱크 반응기(continuous stirred tank reactor)와 직렬로 연결된 플러그 플로우 반응기(plug flow reactor)로 모델링되며, 역추적자(inverse tracer) 실험을 통해 운전 중 주기적으로 추정된다. 추정된 체류시간 분포는 최소 체류시간(minimum residence time)을 정량화하며, 이는 공급 유량을 조정하는 데 사용된다. 제어기 검증 실험은 pH 및 최소 체류시간 설정값 추종(setpoint tracking)과 교란(disturbance) 억제가 빠르고 정확한 응답과 함께 달성되며 불안정성이 없음을 보여준다. 바이러스 불활성화 시험 결과는 연장된 운전 기간 동안 로그 감소값(logarithmic reduction values)이 엄격하게 제어됨을 입증한다. 본 연구는 생산성을 높이고 제품 품질을 개선하며 환자 안전을 강화한다는 목적에 기여하는 연속 바이러스 불활성화 시스템의 설계 및 운전에 필요한 도구를 제공한다.

메틸영양 효모인 Pichia pastoris는 재조합 단백질 생산을 위한 미생물 숙주로 널리 사용된다. P. pastoris에 대한 생물반응기 모델은 세포 대사의 이해에 정보를 제공할 수 있으며, 생물반응기 운전의 최적화를 위해 활용될 수 있다. 이 논문에서는 기질, 생체량, 총 단백질, 기타 배지 성분, 그리고 배출가스(off-gas) 성분을 기술하는 P. pastoris를 위한 광범위한 거시적 생물반응기 모델을 구축한다. 매질 성분과 배출가스 성분의 흡수 및 생성(진화) 속도를 설명하기 위해 종(species) 및 원소(elemental) 수지 방정식을 도입한다. 또한 재조합 단백질의 생성과 배지 성분의 침전(precipitation)을 설명하기 위해, 전체 전하 수지(overall charge balance), 산/염기 평형, 그리고 활동도 계수(activity coefficients)를 이용한 pH 모델을 구축한다. 반복 운전(run-to-run) 간 변동성의 범위는 모델 파라미터의 일부에 대한 분포로 모형화하며, 최대우도(maximum likelihood) 방법을 사용하여 이를 추정한다. 광범위한 거시적 생물반응기 모델로부터의 예측은 서로 다른 운전 조건에서의 실험 데이터를 잘 설명한다. 파라미터 분포로부터 정량화된 모델 예측의 확률 분포는 실험 데이터에서 관찰된 반복 운전 간 변동성과 정량적으로 일관된다. 이 거시적 생물반응기 모델에서의 불확실성 기술은 변동성이 큰 모델 파라미터를 식별하고, 추가적인 실험 연구에서 세포 대사의 어느 측면에 초점을 맞춰야 하는지에 대한 지침을 제공한다. pH 및 침전을 포함하는 배지 성분에 대한 모델은 세포의 요구를 충족하면서 필요한 성분의 양을 최소화함으로써 화학적으로 정의된 배지의 개선에 활용될 수 있다.

의학적 관련성이 있는 단백질을 포함하여 단백질의 결정화는 단백질 구조를 이해하고 치료제를 설계하는 등 다양한 이유로 수행된다. 핵생성과 성장의 속도법칙(rate law)에서 동역학 상수, 특히 거대분자 집합체인 캡시드와 같은 고도 생물치료제의 동역학 상수를 얻는 것은 결정화 공정의 설계에 있어 어렵지만 필수적이다. 본 연구에서는 재조합 아데노부속바이러스(recombinant adeno-associated virus, rAAV) 캡시드의 결정화에 대해 핵생성과 성장의 동역학을 추출하기 위해 결합된 집단균형(population balance) 및 종(species) 균형 방정식을 개발하였다. 매달린 방울(hanging-drop) 증기확산(vapor diffusion) 시스템에서의 캡시드 결정화에 대한 실험 데이터와 모델 결과를 비교한 결과, 방울로부터의 증기 확산의 느린 속도가 초기 핵생성과 성장 과정의 지배요인임을 보여주었으며, 캡시드의 핵생성은 미세방울에서 이종핵생(heterogeneous nucleation)을 통해 일어난다. 또한 분자량이 매우 높은(∼3.6 MDa) 캡시드가 구형의 외부 구조/형상을 지니기 때문에 글리신(∼75 Da)과 같은 소형 유기물, 저분자량 단백질, 그리고 소분자 활성 제약성분(active pharmaceutical ingredients)과 유사한 핵생성 경향을 보인다는 결과도 확인되었다. 캡시드는 단백질 및 기타 거대분자에서와 마찬가지로 핵생성 기간이 연장되지만, 성장률은 매우 낮으며 성장률 전자계수(growth rate prefactor)는 리소자임(lysozyme)보다 7자릿수(orders of magnitude) 낮다. 캡시드의 결정 성장률은 리소자임에 비해 과포화(supersaturation)에 대한 민감도가 약하며, 매우 높은 분자량으로 인해 느린 브라운 운동(brownian motion)으로 인한 캡시드의 수송(이동)에 의해 제한된다.

단백질의 결정화, 특히 의학적으로 관련된 단백질의 결정화는 단백질 구조를 이해하고 치료법을 설계하기 위해 등 다양한 이유로 수행된다. 고급 생물치료제 예컨대 카프시드(capsid)와 같이 거대분자로 이루어진 조립체의 핵생성과 성장에 대한 속도법칙(rate law)에서 동역학 상수(kinetic constants)를 얻는 일은 결정화 공정 설계에 필수적이며 또한 어렵다. 본 연구에서는 재조합 아데노-관련 바이러스(recombinant adeno-associated virus, rAAV) 카프시드의 결정화에 대해 핵생성과 성장의 동역학을 추출하기 위해 결합된 집단균형(population balance) 및 종( species ) 균형 방정식을 개발하였다. 현수방울(hanging-drop) 증기 확산(vapor diffusion) 시스템에서의 카프시드 결정화에 대해, 모델 결과를 실험 데이터와 비교한 결과, 방울로부터의 증기 확산이 느린 속도가 초기 핵생성과 성장 과정들을 지배하며, 카프시드의 핵생성은 미세방울(microdroplet)에서 이종핵생성(heterogeneous nucleation)을 통해 일어남을 보여주었다. 또한 분자량이 매우 큰(~3.6 MDa) 카프시드는 구형의 외부 구조/형상 때문에, 글리신(75 Da)과 같은 소분자 유기물, 저분자량 단백질, 그리고 소분자 활성 제약 성분(active pharmaceutical ingredients)과 유사한 핵생성 경향을 보인다는 결과도 확인되었다. 카프시드는 단백질 및 기타 거대분자와 마찬가지로 핵생성 기간이 연장되지만, 성장 속도는 느리며, 성장 속도 전-계수(growth rate pre-factor)는 리소자임(lysozyme)보다 7자리(orders of magnitude) 차수만큼 더 작다. 카프시드 결정 성장 속도는 리소자임에 비해 과포화(supersaturation)에 대한 민감도가 약하며, 매우 높은 분자량으로 인한 느린 브라운 운동(Brownian motion) 때문에 카프시드의 수송(transport)에 의해 제한된다.

재조합 아데노부속바이러스(rAAV, recombinant adeno-associated virus)는 비병원성, 장기간의 유전자 도입체 발현, 광범위한 조직/세포 표적 특이성(tropism), 분열 및 비분열 세포 모두를 감염(transduce)시킬 수 있다는 점 때문에 체내(in vivo) 유전자 치료에서 널리 사용되는 벡터이다. 그러나 포유류 세포의 일과성(transient) 형질전환을 통한 rAAV 벡터 생산은 통상적으로 채워진(filled) 캡시드가 전체 캡시드에 차지하는 비율이 낮으며(총 생산 캡시드의 약 1–30%), 약하게 채워진 정도가 나타난다. 우리가 이전에 개발한 rAAV2/5 생산의 기전적 모델 분석에서는 이러한 낮은 충전(fill) 비율이 캡시드 합성과 바이러스 DNA 복제 사이의 조율이 부적절한 시간적 동기화(timeline) 때문이며, 또한 Rep 단백질에 의한 후반 단계의 캡시드 형성 억제가 원인으로 해석되었다. 여기서는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포에 대한 다중 투여(multiple dosing) 형질전환을 이용하여, 전체 Rep 단백질의 발현 동역학과 이것이 rAAV2/5 생산의 핵심 단계들에 미치는 영향을 정량화함으로써 모델을 확장하였다. 그 결과, 사전에 형성된 빈(empty) 캡시드의 가용성과 세포당 바이러스 DNA 사본 수는 캡시드 충전 반응에 제한 요인이 아님을 보고한다. 그러나 Rep 단백질의 최적 발현(세포당 < 240 ± 13 ag)이 상류 단계에서 충전된 캡시드 집단의 농축(> 12%의 전체 캡시드/세포)을 가능하게 한다. 우리의 분석은 Rep 단백질 발현을 조절함으로써 충전된 캡시드의 농축을 더욱 증가시킬 수 있으나, 이는 3중 플라스미드(triple plasmid) 형질전환에서 세포당 캡시드 역가(capsid titer)가 감소하는 대가를 치른다는 점을 시사한다. 본 연구는 rAAV2/5 벡터 게놈(vg) 생산의 규모 확장(scaling)에 내재된 한계를 규명하며, 상류 단계에서 세포당 vg 역가를 최대화하기 위해 Rep 단백질 발현을 조절할 수 있는 접근법의 필요성을 강조한다.