펩티도글리칸 DL-엔도펩티다아제는 세균 세포벽의 펩티도글리칸에서 펩타이드 줄기를 국소적으로 절단한다. 이 과정은 경직된 펩티도글리칸 층을 느슨하게 함으로써 세균의 성장과 분열을 촉진한다. IseA는 여러 DL-엔도펩티다아제의 활성 부위에 결합하여 세포 용해를 초래하는 과도한 펩티도글리칸 분해를 억제한다. IseA가 DL-엔도펩티다아제 활성을 어떻게 억제하는지 더 잘 이해하기 위해, 펩티도글리칸 DL-엔도펩티다아제 CwlO/IseA 복합체의 결정 구조를 규명하고, 이를 펩티도글리칸 DL-엔도펩티다아제 LytE/IseA 복합체의 구조와 비교하였다. 구조 분석 결과, DL-엔도펩티다아제의 소수성 포켓 결합 잔기 사이에는 유의미한 차이가 확인되었다( CwlO의 F361과 LytE의 W237 ). 또한 결합 분석 결과, CwlO의 F361을 더 부피가 큰 소수성 잔기인 트립토판으로 치환하면 IseA에 대한 결합 친화도가 증가한 반면, 알라닌으로 치환하면 친화도가 감소하였다. 이러한 분석을 통해 DL-엔도펩티다아제의 소수성 포켓 결합 잔기가 IseA-결합 친화도를 결정하며, IseA에 의한 기질 모방적(서브스트레이트-미메틱) 억제에 필요하다는 점이 밝혀졌다.

동일한 오페론 내에서 조절되므로, 키나아제 활성에서 McsA의 역할은 아직 명확히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 McsA가 키나아제 활성을 조절하는 분자적 기전을 규명하였다. McsAB 복합체의 결정 구조는 McsA가 두 번째 아연-배위 결합 도메인과 이어지는 루프 영역을 통해 McsB 키나아제 도메인에 결합함을 보여준다. 이러한 결합은 촉매 부위를 재배열하여 McsB의 자기 조립을 방지하고, 정량적 기질 결합을 증진함으로써 McsB 키나아제 활성을 활성화한다. McsA의 첫 번째 아연-배위 결합 도메인과 코일드-코일 도메인은 McsAB 올리고머를 재조립함으로써 추가로 McsB를 활성화한다. 본 결과는 McsA가 단백질-아르기닌 키나아제(단백질-arginine kinase) 홀로효소의 재구성(reconstitution)을 위한 조절 소단위체임을 입증한다. 본 연구는 단백질-아르기닌 키나아제가 세포의 단백질 분해 시스템을 어떻게 지시하는지에 대한 구조적 통찰을 제공한다.

Arabidopsis에서 GIGANTEA(GI)는 청색광 수용체인 ZTL, LKP2, FKF1과 함께 핵심 시계 단백질 TOC1 및 개화 억제자인 CDF들을 분해 조절함으로써 일주기 진동과 개화를 조절한다. 다양한 식물 생리에서 GI의 중요성에도 불구하고, 단백질 제조 과정의 기술적 문제와 구조 정보의 부재로 인해 그 분자적 기능은 충분히 이해되지 못한 실정이다. 본 연구에서는 GI 단량체의 정제와 GI/LKP2 복합체의 결정 구조를 보고한다. 결정 구조는 GI의 1-813번 잔기가 소수성 α-나선들을 적층하여 형성된 길쭉하고 경직된 구조를 가지며, LKP2의 LOV 도메인이 GI의 중간 영역(563-789번 잔기)에 결합함을 보여준다. 상호작용 분석 결과는, GI 결합에 의해 LOV 동종이량체가 단량체로 전환됨을 추가로 시사한다. 본 연구 결과는 GI와 ZTL/LKP2/FKF1에 의한 일주기 시계와 광주기성 개화의 조절에 관한 구조적 통찰을 제공한다.

펩티도글리칸 DL-엔도펩티다아제는 세균 세포벽의 펩티도글리칸에서 펩타이드 줄기를 국소적으로 절단한다. 이 과정은 경직된 펩티도글리칸 층을 느슨하게 함으로써 세균의 성장과 분열을 촉진한다. IseA는 여러 DL-엔도펩티다아제의 활성 부위에 결합하여 세포 용해를 초래하는 과도한 펩티도글리칸 분해를 억제한다. IseA가 DL-엔도펩티다아제 활성을 어떻게 억제하는지 더 잘 이해하기 위해, 펩티도글리칸 DL-엔도펩티다아제 CwlO/IseA 복합체의 결정 구조를 규명하고, 이를 펩티도글리칸 DL-엔도펩티다아제 LytE/IseA 복합체의 구조와 비교하였다. 구조 분석 결과, DL-엔도펩티다아제의 소수성 포켓 결합 잔기 사이에는 유의미한 차이가 확인되었다( CwlO의 F361과 LytE의 W237 ). 또한 결합 분석 결과, CwlO의 F361을 더 부피가 큰 소수성 잔기인 트립토판으로 치환하면 IseA에 대한 결합 친화도가 증가한 반면, 알라닌으로 치환하면 친화도가 감소하였다. 이러한 분석을 통해 DL-엔도펩티다아제의 소수성 포켓 결합 잔기가 IseA-결합 친화도를 결정하며, IseA에 의한 기질 모방적(서브스트레이트-미메틱) 억제에 필요하다는 점이 밝혀졌다.

동일한 오페론 내에서 조절되므로, 키나아제 활성에서 McsA의 역할은 아직 명확히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 McsA가 키나아제 활성을 조절하는 분자적 기전을 규명하였다. McsAB 복합체의 결정 구조는 McsA가 두 번째 아연-배위 결합 도메인과 이어지는 루프 영역을 통해 McsB 키나아제 도메인에 결합함을 보여준다. 이러한 결합은 촉매 부위를 재배열하여 McsB의 자기 조립을 방지하고, 정량적 기질 결합을 증진함으로써 McsB 키나아제 활성을 활성화한다. McsA의 첫 번째 아연-배위 결합 도메인과 코일드-코일 도메인은 McsAB 올리고머를 재조립함으로써 추가로 McsB를 활성화한다. 본 결과는 McsA가 단백질-아르기닌 키나아제(단백질-arginine kinase) 홀로효소의 재구성(reconstitution)을 위한 조절 소단위체임을 입증한다. 본 연구는 단백질-아르기닌 키나아제가 세포의 단백질 분해 시스템을 어떻게 지시하는지에 대한 구조적 통찰을 제공한다.

Arabidopsis에서 GIGANTEA(GI)는 청색광 수용체인 ZTL, LKP2, FKF1과 함께 핵심 시계 단백질 TOC1 및 개화 억제자인 CDF들을 분해 조절함으로써 일주기 진동과 개화를 조절한다. 다양한 식물 생리에서 GI의 중요성에도 불구하고, 단백질 제조 과정의 기술적 문제와 구조 정보의 부재로 인해 그 분자적 기능은 충분히 이해되지 못한 실정이다. 본 연구에서는 GI 단량체의 정제와 GI/LKP2 복합체의 결정 구조를 보고한다. 결정 구조는 GI의 1-813번 잔기가 소수성 α-나선들을 적층하여 형성된 길쭉하고 경직된 구조를 가지며, LKP2의 LOV 도메인이 GI의 중간 영역(563-789번 잔기)에 결합함을 보여준다. 상호작용 분석 결과는, GI 결합에 의해 LOV 동종이량체가 단량체로 전환됨을 추가로 시사한다. 본 연구 결과는 GI와 ZTL/LKP2/FKF1에 의한 일주기 시계와 광주기성 개화의 조절에 관한 구조적 통찰을 제공한다.

성장.

ABSTRACT McsAB는 단백질-아르기닌 키나아제로서 전사 억제자인 CtsR을 억제함으로써 열충격 유전자를 활성화한다. 그러나 열충격 동안 McsAB가 CtsR을 억제하는 기전은 아직 명확하지 않다. 본 연구에서는 Bacillus subtilis의 McsAZ2-McsB와 CtsR의 복합체에 대한 냉동전자현미경(cryo-electron microscopy) 구조를 제시한다. 구조 분석 결과, McsAZ2-McsB는 막대 모양의 이이종사중체(heterotetramer)를 형성하며, 이들 이이종사중체 중 두 개가 McsB의 인산화 아르기닌 잔기(pArg194 및 pArg333)를 통해 비대칭적으로 교차하는 형상을 이루는 것으로 나타났다. CtsR 이량체는 McsA의 pArg115 및 McsB의 pArg194를 통해 McsAZ2-McsB 올리고머의 홈(groove)에 결합한다. 이방성(anisotropy) 실험은 열충격 동안 CtsR이 조작자(operator)로부터 천천히 분리되며, McsAB가 ATP 의존적으로 이 과정을 촉진함을 시사한다. 또한 McsAB의 아르기닌 잔기에 대한 변이는 열충격 동안 CtsR을 탈취(hijack)하는 능력을 감소시킨다. 이러한 결과는 McsAB의 자가인산화(autophosphorylation)가 신속하고 효과적인 열충격 반응에 필수적임을 보여준다.

가이베렐린은 성장 억제 단백질 DELLA를 하향 조절함으로써 식물 생장을 촉진한다. 가이베렐린 수용체 GID1은 가이베렐린이 존재하는 경우 DELLA 단백질에 결합하며, 그 결과 SCF SLY1/GID2 유비퀴틴 E3 리가아제에 의한 다중 유비퀴틴화(polyubiquitination) 과정을 통해 DELLA 단백질의 분해가 유도된다. 광범위한 연구에도 불구하고, DELLA 단백질이 SCF SLY1/GID2와 조립하여 식물 생장을 조절하는 분자적 기전은 여전히 충분히 규명되지 않았다. 본 연구에서는 Arabidopsis thaliana(애기장대) DELLA 단백질 RGA가 각각 GID1A 및 GID1A-SLY1-ASK2와 복합체를 이루는 두 가지 cryo-electron microscopy(크라이오 전자현미경) 구조를 제시한다. 구조 분석 결과 RGA는 GID1A 및 SLY1과 서로 겹치지 않는 결합 표면을 통해 상호작용하여 단백질을 안정화하는 것으로 나타났다. 이는 SCF SLY1–RGA–GID1A 복합체가 가이베렐린에 의해 유도되는 단계적 안정화(stepwise stabilization)를 통해 조립됨을 시사한다. 또한 구조는 RGA가 SLY1에 결합된 상태에서는 IDD 계열 전사인자와 상호작용하지 않음을 보여주며, 이는 DELLA 단백질의 GID1/SLY1 및 전사인자에 대한 결합이 상호 배타적임을 의미한다. 이러한 결과는 가이베렐린에 반응하여 DELLA 단백질이 전사인자 활성에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 통찰을 제공한다.

저온 전자현미경(cryo-electron microscopy, cryo-EM)은 준-원자 수준의 해상도에서 거대분자 구조를 규명하는 데 널리 사용되는 기법이다. cryo-EM 구조 분석에 적합한 입자 크기의 이론적 하한은 38 kDa로 추정되며, 일반적인 제약은 영상 콘트라스트와 입자 정렬 정확도 등의 요인을 포함한다. 본 연구에서는 이러한 하한 크기 임계값에 근접한 두 개의 단백질-리간드 복합체의 cryo-EM 구조를 제시한다. 첫째, 구조적으로 정렬된 질량이 40.8 kDa인 말토스-결합 단백질(maltose-binding protein)과 말토스의 복합체 구조를 해상도 2.4 Å에서 규명하였으며, 이 구조에서 말토스와 물 분자 모두가 명확하게 확인되었다. 둘째, 구조적으로 정렬된 질량이 31.6 kDa로 이론적 38 kDa 하한보다 낮은, 인간 PLK1의 키나아제 도메인과 onvansertib의 복합체 구조를, β-octyl-glucoside 존재 하에서 gold-supported grid를 사용하여 해상도 3.4 Å에서 규명하였다. 밀도 지도는 PLK1의 이차구조 백본을 명확히 보여주며, onvansertib. 이러한 결과는 cryo-EM이 작은 단백질 또는 도메인의 구조를 규명하는 데 효과적으로 활용될 수 있으며, 구조적 기준표지자(fiducials) 없이도 작은 단백질에 대한 구조 기반 약물 스크리닝을 수행할 수 있음을 보여준다.