세포외 소포체(extracellular vesicles, EVs)는 대부분의 세포에서 분비되는 나노 크기의 구형 및 지질 이중층을 갖는 입자이다. 종양 미세환경은 면역세포 및 내피세포와 같은 간질(stromal) 세포와의 역동적 상호작용에 의해 복잡하고 고도로 조절되는 체계이다. 혈관신생(angiogenesis)은 기존 혈관에서 새로운 모세혈관이 형성되는 과정으로, 증식하는 종양세포에 산소와 영양분을 공급함으로써 종양형성과 암 진행에서 중요한 역할을 한다. EVs가 병태생리학적 상황에서 세포 간 의사소통의 중요한 매개자로 부상함에 따라, 시험관 내에서 배양한 종양세포 및 기타 세포에서 유래한 EVs의 혈관신생 촉진 활성을 보고한 여러 연구들이 있다. 그러나 생체 내 종양 조직에서 직접 분리한 EVs의 혈관신생 역할은 조사되지 않았다. 본 연구에서는 마우스 1차 종양 조직으로부터 고순도로 EVs를 직접 분리하고, 생체 내 종양 조직 유래 EVs( tumor tissue-derived EVs, tEVs)의 혈관신생 잠재력을 평가하였다. 정제된 종양 tEVs는 나노 크기의 구형 및 지질 이중층 구조를 갖는 EV-유사 특징을 보였으며, 테트라스패닌(tetraspanins)과 같은 EV 표지 단백질이 풍부하였다. 반면 골지체 및 핵(nucleus) 유래 단백질은 감소되어 있었다. 흥미롭게도 종양 tEVs는 생체 내 Matrigel plug assay에서 광범위한 신생혈관형성과 다수의 대식세포 침윤을 촉진하였다. 또한 종양 tEVs의 혈관신생 특성은 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)라는 혈관신생 촉진 분자를 생성함으로써 침윤된 대식세포에 의해 매개되었다. 이러한 결과는 종양 tEVs가 대식세포의 모집을 직접 촉진하고 침윤된 대식세포를 활성화하여 VEGF를 생성함으로써 생체 내에서 강력한 혈관신생 활성을 갖는다는 점을 시사한다. 본 연구는 종양 미세환경에서 종양 tEV 매개 신생혈관형성에 있어 침윤 대식세포의 VEGF 생성이 핵심적 역할을 한다는 점에 대한 최초의 직접적 증거를 제공한다.

종양 미세환경으로의 T 세포 유입. 이러한 데이터는 차세대 암 면역치료제 개발을 위한 새로운 후보로서 대량 생산된 E. coli OMV의 강력한 항종양 활성을 보여준다.

형광 표지는 단일 입자 수준까지 소포를 영상화하고 추적할 수 있게 한다. 형광을 도입하는 여러 방법 중에서도, 지질 막을 친유성 염료로 염색하는 방식은 소포의 내용물을 방해하지 않으면서도 손쉽고 간단한 접근을 제공한다. 그러나 수용액에서 친유성 분자를 소포 막에 통합하는 일은 일반적으로 친유성 분자의 낮은 물 용해도로 인해 비효율적이다. 본 연구에서는 천연 세포외 소포를 포함한 소포에 대한 형광 표지를 위한 단순하고 빠르며(<30분), 매우 효과적인 절차를 제시한다. 염색 완충액의 이온 강도를 NaCl로 조절함으로써, 대표적 친유성 추적자인 DiI의 응집 상태를 가역적으로 제어할 수 있다. 세포 유래 소포를 모델 시스템으로 사용하여, 저염 조건에서 DiI를 분산시키면 소포로의 통합이 290배 향상됨을 확인하였다. 또한 표지 후 NaCl 농도를 증가시키면 유리 염료 분자들이 응집체를 형성하며, 이는 여과를 통해 제거할 수 있어 초원심분리 없이도 효과적으로 제거된다. 다양한 종류의 염료와 소포에 걸쳐 표지된 소포 수는 일관되게 6~85배 증가하였다. 본 방법은 고농도의 염료 사용으로 인한 비표적 표지(off-target labeling)에 대한 우려를 줄일 것으로 기대된다.

세포외 소포(extracellular vesicles, EVs)는 지질 이중층으로 둘러싸인 나노 크기의 소포로, 대부분의 세포에서 세포외 환경으로 방출된다. 다양한 EV 분리 방법이 확립되어 있음에도 불구하고, 현재의 대부분의 방법은 오염된 비(非)소포성 단백질을 함께 포함한 EV를 분리한다. 사람 결장암 세포 SW480에서 유래한 EV에 대해 무표지 정량 단백질체 분석(label-free quantitative proteomic analyses)을 적용함으로써, 우리는 트립신에 민감한(trypsin-sensitive) 소포성 단백질과 트립신에 저항성인(trypsin-resistant) 소포성 단백질을 확인하였다. 이어서 세포 내 위치에 기반한 추가적인 시스템 생물학 및 단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석을 통해, 트립신에 민감한 및 트립신에 저항성인 소포성 단백질을 두 하위 집단으로 분류하였다. 즉 363개의 후보 진성 소포성 단백질(candidate real-vesicular proteins)과 151개의 오염된 비소포성 단백질(contaminated non-vesicular proteins)이다. 또한 단백질 상호작용 네트워크 분석 결과, 후보 진성 소포성 단백질은 주로 세포막(plasma membrane, 46.8%), 세포질(cytosol, 36.6%), 세포골격(cytoskeleton, 8.0%), 세포외 영역(extracellular region, 2.5%)에서 유래한 것으로 나타났다. 반면 오염된 비소포성 단백질의 대부분은 핵(nucleus), 골지체(Golgi apparatus), 소포체(endoplasmic reticulum) 및 미토콘드리아(mitochondria)에서 유래하였다. 더불어 리보솜 단백질 복합체(ribosomal protein complexes)와 T-복합체 단백질(T-complex proteins)은 오염된 비소포성 단백질로 분류되었다. 종합하면, EV에 대한 우리의 트립신 처리(proteomic) 기반 접근법은 EV 방출 시 EV 생합성 및 단백질 화물 선택(protein cargo-sorting) 기작을 이해하는 데 도움이 될 수 있는 진성 소포성 단백질을 규명하고, 보다 신뢰할 수 있는 EV 진단 바이오마커 단백질을 발굴하며, EV의 병태생리학적 역할을 해독하는 데 중요한 진전을 제공한다.

EV는 암 폐 전이를 촉진할 수 있는 잠재적 매개체이다.

피터 J. 퀴센버리(Peter J. Quesenberry, MD)는 조혈, 줄기세포 생물학, 그리고 세포외 소포(extracellular vesicle, EV) 연구를 잇는 데 기여한 선구적 의사-과학자로서 2025년 11월 13일, 87세의 나이로 세상을 떠났다. 퀴센버리 교수는 50년이 넘는 기간 동안 실험 조혈학 분야를 선도한 핵심 인물로, EV 생물학을 엄격한 동시에 중개 가능한 과학적 학문으로 정립하는 데 형성자적 역할을 수행하였다. 그는 혈액종양내과(hematologist–oncologist)로 훈련받았으며, 조혈 줄기세포의 이질성, 세포주기 의존적 줄기세포 거동, 그리고 골수의 가소성(bone marrow plasticity)에 대한 이해에 중대한 기여를 했다. 경력 후반기에는 줄기세포 생물학에 EV를 통합한 초기 연구자 중 한 명으로, EV가 세포 운명(cell fate), 조직 손상 복구(tissue repair), 그리고 표현형 변조(phenotypic modulation)를 매개하는 강력한 매개자임을 보여주는 개념을 발전시켰다. 이러한 연구는 EV의 생물학적 및 임상적 관련성을 입증함으로써 해당 분야의 중개적 전환을 촉진하는 데 기여하였다. 퀴센버리 교수의 EV 분야에 대한 영향은 그의 연구실을 훨씬 넘어 확장되었다. 피터는 국제 세포외 소포 학회(International Society of Extracellular Vesicles, ISEV)의 집행이사회(Executive Board)에서 2012년(첫 ISEV 이사회)부터 2016년까지 2차례에 걸쳐 ‘대외이사(Member at Large)’로 선출되었다. 또한 그는 클로틸드 테리(Clotilde Thery), 용 송 고(Yong Song Gho)와 함께 2012년부터 2019년까지 Journal of Extracellular Vesicles(세포외 소포 저널)의 초대 편집장(Editor-in-Chief)들이었으며, 저널의 과학적 범위, 편집 기준, 그리고 글로벌 가시성 형성에 핵심적 역할을 수행하였다(Théry et al. 2019). 이러한 공로를 인정받아 그는 2014년에 ISEV 특별 공로상(ISEV Special Achievement Award)을 공동으로 수상하였는데, 이는 EV 과학과 학회 자체에 대한 그의 기초적 기여를 함께 기리는 것이었다. 다작의 학자였던 퀴센버리는 400편이 넘는 동료심사 논문과 100개가 넘는 서적 장(chapter)을 저술했으며, 그중 다수는 연속되는 세대의 혈액학자, 줄기세포 생물학자, 그리고 EV 연구자들에게 영향을 미쳤다. 동등하게 중요한 것은 그가 훌륭한 멘토이자 지적 촉매로서 수행한 역할로, 기존의 통념에 도전하고 개념적 위험 감수를 장려하며 학제 간 사고를 촉진하는 것으로 알려져 있었다. 그의 유산은 단지 그의 발견에만 반영되는 것이 아니라, 그가 훈련시킨 과학자들과 임상-연구자(clinician-investigators)들에서도 드러나며, 그들 다수는 오늘날에도 EV 및 줄기세포 분야를 계속 형성해 나가고 있다. 사진: 2012년, 고텐부르크에서 열린 제1회 ISEV 연례회의에서 피터 퀴센버리가 발표하는 모습. 사진 제공: Jan Kwarnmark.

대부분의 암세포는 워버그 효과(Warburg effect)로 알려진 고수준의 포도당 흡수 후 젖산 생성에 이르는, 호기성 해당과정(aerobic glycolysis)이라는 비효율적인 대사 과정을 채택한다. 이러한 표현형 전이는 암세포가 저산소성의 가혹한 종양 미세환경에서 생존과 증식을 증가시킬 수 있게 한다. 또한 생성된 산성 미세환경은 T세포 기능 손상과 같은 면역계의 비활성화를 유발하여 면역 감시로부터의 회피를 유리하게 만든다. 종양 유래 EV(세포외 소포)가 인접한 세포에 모세포의 물질을 전달하고 종양성(oncogenic) 재프로그래밍에 기여할 수 있음을 밝힌 많은 연구가 있었으나, 에너지 대사에서의 그 기능은 충분히 다루어지지 않았다. 본 연구에서는 젖산에 의해 구동되는 산성 배양 배지에서 세포사멸에 저항성을 보이는 전립선암 세포 PC-3AcT를 확립하였다. PC-3 및 PC-3AcT 세포에서 유래한 EV 간 정량적 단백질체 분석을 통해 935개의 신뢰할 수 있는 EV 단백질을 확인하였다. 젖산성 산증(lactic acidosis)에 대한 세포 적응에 근거하여, 에너지 대사, 세포 형태, 세포외 기질과 관련된 159개의 조절된 EV 단백질을 규명하였다. 이들 EV에는 해당과정(glycolytic) 효소가 높은 비율로 포함되어 있었다. 특히 PC-3AcT EV는 아포지단백(apolipoprotein) B-100 (APOB)을 포함한 아포지단백이 풍부하게 축적되어 있었다. PC-3AcT EV의 APOB는 수용 세포인 PC-3의 저밀도 지단백 수용체(low density lipoprotein receptor)에 의존하여 이들의 내재화(endocytic uptake)를 촉진할 수 있었으며, 헥소키나아제(hexokinases)와 포스포프럭토키나아제(phosphofructokinase)의 활성 및 발현 증가를 통해 산성 배양 배지에서 세포 증식과 생존을 증가시키는 결과를 보였다. 수용 PC-3 세포의 활성화는 포도당 소비와 ATP 생성의 증가로 이어져, 워버그 표현형으로의 획득된 대사 재프로그래밍을 나타낸다. 본 연구는 전립선암 세포 유래 EV가 에너지 대사 재프로그래밍에 기여할 수 있으며, 수용 세포에서의 획득된 대사 표현형 전이가 종양 미세환경에서의 세포 생존을 유리하게 할 수 있음을 처음으로 규명하였다.

뇌척수액(CSF)은 척추옆(paravertebral) 림프절을 통해 전신 림프계로 배출된다. 피하 및 심부 경부 림프절은 마우스에서 CSF를 수집하지만, 정확한 경로와 정량화된 경로는 알려져 있지 않다. 최근 우리는, 척수강 내(intrathecal) [64Cu]Cu-알부민 양전자방출단층촬영에서 연속 영상으로 경부, 천추(sacral), 장골(iliac) 림프절을 동시에 시각화하였다. 척추옆 림프절(paravertebral lymph nodes)은 CSF, 뇌 및 척수의 상태를 모니터하는 감시자(sentinel) 역할을 할 수 있다. 우리는 64Cu 표지 Escherichia coli의 세포외 소포(extracellular vesicles)인 바깥막 소포(outer membrane vesicles, OMVs)를 림프절 탐색체(lymph node seekers)로 사용하여, 최적화된 투여 용적/속도로 척수강 내 투여를 수행하고, 마우스에서 뇌와 척수의 축(axis)을 따라 다양한 척추옆 림프절의 차등적 양을 정량화하였다. 정량 결과, 그 77.3%가 피하 및 심부 경부 림프절에, 11.4%가 복부/골반 림프절에, 11.3%가 천추 림프절에 분포하였다. Click-표지된 [64Cu]Cu-OMVs는 연속 정량 과정에서 림프절에 도달하여 그곳에서 정체되도록 배출되었다. 경부 림프절은 OMV가 적재된 CSF의 대부분을 배출했으며, 이는 마우스에서 뇌(70%)와 척수에 대한 표면적 비례량과 상응하였다. 우리는 모든 척추옆 림프절이, 중추신경계에 대한 즉각적인 감시자 림프절로서 뇌와 척수의 분절(segmental) 영역을 모니터링한다고 제안한다.

막 결합 소포인 세포외 소포(extracellular vesicles, EVs)는 표적 세포에 대한 생화학적 효과인자로 기능할 수 있다. 소포가 수용체 세포의 원형질막에 도킹되는 과정은 소포 표면이 세포 표면 단백질과 상호작용하는지에 달려 있지만, 이러한 소포-단백질 상호작용(vesicle-protein interactions, VPIs)을 정량적으로 관찰할 수 있는 일반화 가능한 기법은 부족하다. 본 연구에서는 단일 소포와 세포 표면 단백질 간의 VPIs를 표면 고정 또는 막에 내재된 상태에서 측정하는 형광 현미경을 제시한다. 세포 유래 소포(cell-derived vesicles, CDVs)와 세포간 부착 분자-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)을 모델 시스템으로 사용하여, 적분린(integrin)에 의해 구동되는 VPI가 소포의 기원에 따라 친화성의 서로 다른 양상을 나타냄을 확인하였다. 또한 단백질의 표면 밀도를 조절한 결과, 분자적 근접성에 대한 결정적 의존성과 함께 테트라스패닌(tetraspanin) 단백질 CD9가 강력한 지지 요인임이 드러났다. 다수의 단백질 분자를 고려하는 흡착 모델을 개발하였고, 밀도 의존적 협동성의 특성을 포착하였다. 우리는 VPI 영상화가 소포의 부착과 섭취에 관여하는 분자 기전을 해부하는 데 유용한 도구가 되며, 치료용 소포의 개발을 안내할 수 있을 것으로 기대한다.

세포외 소포체(extracellular vesicles, EVs)는 대부분의 세포에서 분비되는 나노 크기의 구형 및 지질 이중층을 갖는 입자이다. 종양 미세환경은 면역세포 및 내피세포와 같은 간질(stromal) 세포와의 역동적 상호작용에 의해 복잡하고 고도로 조절되는 체계이다. 혈관신생(angiogenesis)은 기존 혈관에서 새로운 모세혈관이 형성되는 과정으로, 증식하는 종양세포에 산소와 영양분을 공급함으로써 종양형성과 암 진행에서 중요한 역할을 한다. EVs가 병태생리학적 상황에서 세포 간 의사소통의 중요한 매개자로 부상함에 따라, 시험관 내에서 배양한 종양세포 및 기타 세포에서 유래한 EVs의 혈관신생 촉진 활성을 보고한 여러 연구들이 있다. 그러나 생체 내 종양 조직에서 직접 분리한 EVs의 혈관신생 역할은 조사되지 않았다. 본 연구에서는 마우스 1차 종양 조직으로부터 고순도로 EVs를 직접 분리하고, 생체 내 종양 조직 유래 EVs( tumor tissue-derived EVs, tEVs)의 혈관신생 잠재력을 평가하였다. 정제된 종양 tEVs는 나노 크기의 구형 및 지질 이중층 구조를 갖는 EV-유사 특징을 보였으며, 테트라스패닌(tetraspanins)과 같은 EV 표지 단백질이 풍부하였다. 반면 골지체 및 핵(nucleus) 유래 단백질은 감소되어 있었다. 흥미롭게도 종양 tEVs는 생체 내 Matrigel plug assay에서 광범위한 신생혈관형성과 다수의 대식세포 침윤을 촉진하였다. 또한 종양 tEVs의 혈관신생 특성은 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)라는 혈관신생 촉진 분자를 생성함으로써 침윤된 대식세포에 의해 매개되었다. 이러한 결과는 종양 tEVs가 대식세포의 모집을 직접 촉진하고 침윤된 대식세포를 활성화하여 VEGF를 생성함으로써 생체 내에서 강력한 혈관신생 활성을 갖는다는 점을 시사한다. 본 연구는 종양 미세환경에서 종양 tEV 매개 신생혈관형성에 있어 침윤 대식세포의 VEGF 생성이 핵심적 역할을 한다는 점에 대한 최초의 직접적 증거를 제공한다.

종양 미세환경으로의 T 세포 유입. 이러한 데이터는 차세대 암 면역치료제 개발을 위한 새로운 후보로서 대량 생산된 E. coli OMV의 강력한 항종양 활성을 보여준다.

형광 표지는 단일 입자 수준까지 소포를 영상화하고 추적할 수 있게 한다. 형광을 도입하는 여러 방법 중에서도, 지질 막을 친유성 염료로 염색하는 방식은 소포의 내용물을 방해하지 않으면서도 손쉽고 간단한 접근을 제공한다. 그러나 수용액에서 친유성 분자를 소포 막에 통합하는 일은 일반적으로 친유성 분자의 낮은 물 용해도로 인해 비효율적이다. 본 연구에서는 천연 세포외 소포를 포함한 소포에 대한 형광 표지를 위한 단순하고 빠르며(<30분), 매우 효과적인 절차를 제시한다. 염색 완충액의 이온 강도를 NaCl로 조절함으로써, 대표적 친유성 추적자인 DiI의 응집 상태를 가역적으로 제어할 수 있다. 세포 유래 소포를 모델 시스템으로 사용하여, 저염 조건에서 DiI를 분산시키면 소포로의 통합이 290배 향상됨을 확인하였다. 또한 표지 후 NaCl 농도를 증가시키면 유리 염료 분자들이 응집체를 형성하며, 이는 여과를 통해 제거할 수 있어 초원심분리 없이도 효과적으로 제거된다. 다양한 종류의 염료와 소포에 걸쳐 표지된 소포 수는 일관되게 6~85배 증가하였다. 본 방법은 고농도의 염료 사용으로 인한 비표적 표지(off-target labeling)에 대한 우려를 줄일 것으로 기대된다.

세포외 소포(extracellular vesicles, EVs)는 지질 이중층으로 둘러싸인 나노 크기의 소포로, 대부분의 세포에서 세포외 환경으로 방출된다. 다양한 EV 분리 방법이 확립되어 있음에도 불구하고, 현재의 대부분의 방법은 오염된 비(非)소포성 단백질을 함께 포함한 EV를 분리한다. 사람 결장암 세포 SW480에서 유래한 EV에 대해 무표지 정량 단백질체 분석(label-free quantitative proteomic analyses)을 적용함으로써, 우리는 트립신에 민감한(trypsin-sensitive) 소포성 단백질과 트립신에 저항성인(trypsin-resistant) 소포성 단백질을 확인하였다. 이어서 세포 내 위치에 기반한 추가적인 시스템 생물학 및 단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석을 통해, 트립신에 민감한 및 트립신에 저항성인 소포성 단백질을 두 하위 집단으로 분류하였다. 즉 363개의 후보 진성 소포성 단백질(candidate real-vesicular proteins)과 151개의 오염된 비소포성 단백질(contaminated non-vesicular proteins)이다. 또한 단백질 상호작용 네트워크 분석 결과, 후보 진성 소포성 단백질은 주로 세포막(plasma membrane, 46.8%), 세포질(cytosol, 36.6%), 세포골격(cytoskeleton, 8.0%), 세포외 영역(extracellular region, 2.5%)에서 유래한 것으로 나타났다. 반면 오염된 비소포성 단백질의 대부분은 핵(nucleus), 골지체(Golgi apparatus), 소포체(endoplasmic reticulum) 및 미토콘드리아(mitochondria)에서 유래하였다. 더불어 리보솜 단백질 복합체(ribosomal protein complexes)와 T-복합체 단백질(T-complex proteins)은 오염된 비소포성 단백질로 분류되었다. 종합하면, EV에 대한 우리의 트립신 처리(proteomic) 기반 접근법은 EV 방출 시 EV 생합성 및 단백질 화물 선택(protein cargo-sorting) 기작을 이해하는 데 도움이 될 수 있는 진성 소포성 단백질을 규명하고, 보다 신뢰할 수 있는 EV 진단 바이오마커 단백질을 발굴하며, EV의 병태생리학적 역할을 해독하는 데 중요한 진전을 제공한다.