세균 및 박테리오파지 RNA 중합효소(RNAP)는 서로 다르게 진화했음에도 불구하고, RNA hairpin 의존적 내재적 전사 종결을 공유한다. 여기서는 우리가 세균 종결을 위해 개발한 단일 분자 형광 분석법을 활용하여 파지 T7, T3 및 SP6 RNAP의 종결을 조사하였다. 그 결과, 파지의 종결 양상 또는 결과는 사실상 단일하며, 종결의 분해(decomposing)를 통해 나타남을 발견하였다. 즉, RNAP는 DNA를 따라 전방으로 이동한 뒤, 한 단계의 분해 과정에서 RNA와 DNA 모두에서 이탈하며, 3차원 확산과 함께 임의의 프로모터에서 재개시가 일어난다. 이러한 파지의 변위-매개 분해 종결은 전사(읽고 통과, readthrough)보다 훨씬 느리며, 세균의 종결과 상동적인 것으로 보인다. 그러나 파지의 단일 종결 양상은 세균의 이중 종결 양상과는 대조적이는데, 세균에서는 분해 종결과 재활용(recycling) 종결이 어떤 단일 hairpin- 또는 Rho 의존적 종결인자에서도 양립 가능하게 나타난다. 세균의 재활용 종결에서는 RNA가 RNA·DNA 하이브리드에서 절단(shearing)되고, RNAP는 DNA에 결합한 채 1차원 확산을 통해 인접한 방향의 하류 또는 상류에 위치한 가장 가까운 프로모터에서 재개시를 촉진하는 재활용이 가능해진다. 세균 유전체에서 대부분의 종결인자가 인접 프로모터와의 근접성을 갖는다는 점에 비추어 볼 때, 절단-매개 재활용 종결은 가까운 프로모터에서 반복적인 재개시를 통해 가속된 발현을 가능하게 하고, 인접한 프로모터들에서 결합된(coupled) 조절을 가능하게 하는 세균의 적응일 수 있다.

전사 정지(transcriptional pause)는 모든 유형의 종결에 필수적이다. 세균의 Rho 인자 의존적 종결자에 대한 단일 분자(single-molecule) 연구에서, 우리는 단일 종결자 내에서 세 가지 Rho 의존적 종결 경로가 상호 양립 가능하게 작동함을 확인하였고, 또한 종결 효율이 예상과는 다른 방식으로 종결 정지(terminational pause)에 의존함을 발견하였다. 분명히 가장 풍부한 경로는 Rho가 새로 합성되는 RNA에 먼저 결합한 뒤 정지된 RNA 중합효소(RNAP)를 따라잡고(catch up), 이 따라잡기(catch-up) Rho가 RNAP로부터 전사된 RNA와 주형(template) DNA의 동시 방출을 매개한다는 것이다. 가장 빠른 경로는 따라잡기 Rho가 RNA만 방출을 유도하여 DNA 상에서 RNAP의 1D 재활용(1D recycling)을 일으키는 것이다. 가장 느린 경로는 RNAP가 선결합된(사전 결합된) 대기 스탠바이(stand-by) Rho가 순차적이 아니라 동시에 방출만을 촉진한다는 것이다. 세 경로 중에서, 스탠바이 Rho의 종결 효율만이 정지 지속 시간(pause duration)과 양의 상관관계를 보이며, 이는 오랫동안 제안되어 온 추측과는 반대로, NusA/NusG 인자, 경쟁(competing) RNA 또는 군집화(crowding) 물질의 부재 또는 존재 하에서도 일관되게 관찰된다. 그에 따라 필수적인 종결 정지는 따라잡기 Rho의 종결에 대해 반드시 길 필요가 없으며, 긴 정지는 오직 스탠바이 Rho의 종결에만 이익이 된다. 또한 mgtA 및 ribB 리보스위치의 Rho 의존적 종결은 주로 따라잡기 종료가 아니라 스탠바이의 조절에 의해 주도된다.

활발히 전사되는 유전자 내 DNA 이중가닥 절단(DSB) 주위에 형성되는 R-loop는 DSB 복구 과정에서 핵심적인 역할을 한다. 그러나 DSB에서 R-loop가 형성되는 기전은 여전히 충분히 이해되지 않았으며, RNA 중합효소(RNAP) 로딩과 관련된 단백질 인자, 정지/후퇴(pausing/backtracking), 혹은 이미 존재하는 전사체 RNA의 침입과 관련된 등 다양한 제안 모델들이 존재한다. 본 단일 분자(single-molecule) 연구에서 Escherichia coli RNAP을 사용하여, 단지 전사 중인 RNAP 자체만으로도 매우 효과적인 DSB 센서로 작용하여 하류(downstream) DSB를 만날 때 R-loop의 생성을 유도하며, 어떠한 추가 인자도 필요하지 않음을 발견하였다. R-loop 형성 효율은 DNA 말단 구조에 크게 좌우되었고, 여기서는 2.8%에서 73%까지 범위로 나타났다. 특히 오버행이 없는 둔단(blunt ends)에 비해 3' 또는 5' 단일가닥 오버행을 갖는 sticky ends에서 R-loop 형성이 현저히 더 높았다. R-loop는 DSB 부위로부터 일방향으로 상류(upstream)로 연장되며 전사 개시 지점까지 도달하여 진행 중인 전사를 방해할 수 있다. 또한 연장된 R-loop는 지속되어 자신의 구조를 유지함으로써 이후 전사 라운드의 효율적인 개시를 효과적으로 차단한다. 본 연구 결과는 5'-말단 침입 모델이나 중간 삽입(middle insertion) 모델보다는 버블 연장(bubble extension) 모델과 일치한다. 이러한 발견은 박테리아, 고세균, 진핵생물 전반에서 전사 주형(transcription template) 상 DSB 복구 개시를 이해하는 데 중요한 통찰을 제공한다.

기능성 효소의 올리고머 상태를 규명하는 것은 촉매 활성에 대한 기작적 이해에 필수적이다. RecQ 헬리케이스는 다양한 생화학적 활성을 보이나, 이러한 활성과 올리고머 상태의 관계는 아직 불분명하다. 우리는 단일 분자 다중 색 형광 이미징을 사용하여, 풀림(unwinding) 및 복제 포크 회귀(replication fork regression) 활성 동안의 베르너 증후군 단백질(Werner syndrome protein, WRN)의 올리고머 상태를 규정한다. 그 결과, WRN은 갈래를 이룬 DNA에 이량체로 결합하며, 올리고머 상태의 변화 없이 이를 풀어낸다는 사실을 밝혀냈다. 반대로 WRN은 복제 포크에 사량체로 결합하며, 복제 포크 회귀의 활성화 동안 이량체로 전환된다. 또한 특정 가닥에서 WRN의 헬리케이스 활성을 선택적으로 억제함으로써, WRN의 활성 이량체가 반복적 풀림과 복제 포크 회귀에 ATP 가수분해의 에너지를 어떻게 서로 다르게 사용하는지 규명한다.

세균 및 박테리오파지 RNA 중합효소(RNAP)는 서로 다르게 진화했음에도 불구하고, RNA hairpin 의존적 내재적 전사 종결을 공유한다. 여기서는 우리가 세균 종결을 위해 개발한 단일 분자 형광 분석법을 활용하여 파지 T7, T3 및 SP6 RNAP의 종결을 조사하였다. 그 결과, 파지의 종결 양상 또는 결과는 사실상 단일하며, 종결의 분해(decomposing)를 통해 나타남을 발견하였다. 즉, RNAP는 DNA를 따라 전방으로 이동한 뒤, 한 단계의 분해 과정에서 RNA와 DNA 모두에서 이탈하며, 3차원 확산과 함께 임의의 프로모터에서 재개시가 일어난다. 이러한 파지의 변위-매개 분해 종결은 전사(읽고 통과, readthrough)보다 훨씬 느리며, 세균의 종결과 상동적인 것으로 보인다. 그러나 파지의 단일 종결 양상은 세균의 이중 종결 양상과는 대조적이는데, 세균에서는 분해 종결과 재활용(recycling) 종결이 어떤 단일 hairpin- 또는 Rho 의존적 종결인자에서도 양립 가능하게 나타난다. 세균의 재활용 종결에서는 RNA가 RNA·DNA 하이브리드에서 절단(shearing)되고, RNAP는 DNA에 결합한 채 1차원 확산을 통해 인접한 방향의 하류 또는 상류에 위치한 가장 가까운 프로모터에서 재개시를 촉진하는 재활용이 가능해진다. 세균 유전체에서 대부분의 종결인자가 인접 프로모터와의 근접성을 갖는다는 점에 비추어 볼 때, 절단-매개 재활용 종결은 가까운 프로모터에서 반복적인 재개시를 통해 가속된 발현을 가능하게 하고, 인접한 프로모터들에서 결합된(coupled) 조절을 가능하게 하는 세균의 적응일 수 있다.

전사 정지(transcriptional pause)는 모든 유형의 종결에 필수적이다. 세균의 Rho 인자 의존적 종결자에 대한 단일 분자(single-molecule) 연구에서, 우리는 단일 종결자 내에서 세 가지 Rho 의존적 종결 경로가 상호 양립 가능하게 작동함을 확인하였고, 또한 종결 효율이 예상과는 다른 방식으로 종결 정지(terminational pause)에 의존함을 발견하였다. 분명히 가장 풍부한 경로는 Rho가 새로 합성되는 RNA에 먼저 결합한 뒤 정지된 RNA 중합효소(RNAP)를 따라잡고(catch up), 이 따라잡기(catch-up) Rho가 RNAP로부터 전사된 RNA와 주형(template) DNA의 동시 방출을 매개한다는 것이다. 가장 빠른 경로는 따라잡기 Rho가 RNA만 방출을 유도하여 DNA 상에서 RNAP의 1D 재활용(1D recycling)을 일으키는 것이다. 가장 느린 경로는 RNAP가 선결합된(사전 결합된) 대기 스탠바이(stand-by) Rho가 순차적이 아니라 동시에 방출만을 촉진한다는 것이다. 세 경로 중에서, 스탠바이 Rho의 종결 효율만이 정지 지속 시간(pause duration)과 양의 상관관계를 보이며, 이는 오랫동안 제안되어 온 추측과는 반대로, NusA/NusG 인자, 경쟁(competing) RNA 또는 군집화(crowding) 물질의 부재 또는 존재 하에서도 일관되게 관찰된다. 그에 따라 필수적인 종결 정지는 따라잡기 Rho의 종결에 대해 반드시 길 필요가 없으며, 긴 정지는 오직 스탠바이 Rho의 종결에만 이익이 된다. 또한 mgtA 및 ribB 리보스위치의 Rho 의존적 종결은 주로 따라잡기 종료가 아니라 스탠바이의 조절에 의해 주도된다.

활발히 전사되는 유전자 내 DNA 이중가닥 절단(DSB) 주위에 형성되는 R-loop는 DSB 복구 과정에서 핵심적인 역할을 한다. 그러나 DSB에서 R-loop가 형성되는 기전은 여전히 충분히 이해되지 않았으며, RNA 중합효소(RNAP) 로딩과 관련된 단백질 인자, 정지/후퇴(pausing/backtracking), 혹은 이미 존재하는 전사체 RNA의 침입과 관련된 등 다양한 제안 모델들이 존재한다. 본 단일 분자(single-molecule) 연구에서 Escherichia coli RNAP을 사용하여, 단지 전사 중인 RNAP 자체만으로도 매우 효과적인 DSB 센서로 작용하여 하류(downstream) DSB를 만날 때 R-loop의 생성을 유도하며, 어떠한 추가 인자도 필요하지 않음을 발견하였다. R-loop 형성 효율은 DNA 말단 구조에 크게 좌우되었고, 여기서는 2.8%에서 73%까지 범위로 나타났다. 특히 오버행이 없는 둔단(blunt ends)에 비해 3' 또는 5' 단일가닥 오버행을 갖는 sticky ends에서 R-loop 형성이 현저히 더 높았다. R-loop는 DSB 부위로부터 일방향으로 상류(upstream)로 연장되며 전사 개시 지점까지 도달하여 진행 중인 전사를 방해할 수 있다. 또한 연장된 R-loop는 지속되어 자신의 구조를 유지함으로써 이후 전사 라운드의 효율적인 개시를 효과적으로 차단한다. 본 연구 결과는 5'-말단 침입 모델이나 중간 삽입(middle insertion) 모델보다는 버블 연장(bubble extension) 모델과 일치한다. 이러한 발견은 박테리아, 고세균, 진핵생물 전반에서 전사 주형(transcription template) 상 DSB 복구 개시를 이해하는 데 중요한 통찰을 제공한다.

기능성 효소의 올리고머 상태를 규명하는 것은 촉매 활성에 대한 기작적 이해에 필수적이다. RecQ 헬리케이스는 다양한 생화학적 활성을 보이나, 이러한 활성과 올리고머 상태의 관계는 아직 불분명하다. 우리는 단일 분자 다중 색 형광 이미징을 사용하여, 풀림(unwinding) 및 복제 포크 회귀(replication fork regression) 활성 동안의 베르너 증후군 단백질(Werner syndrome protein, WRN)의 올리고머 상태를 규정한다. 그 결과, WRN은 갈래를 이룬 DNA에 이량체로 결합하며, 올리고머 상태의 변화 없이 이를 풀어낸다는 사실을 밝혀냈다. 반대로 WRN은 복제 포크에 사량체로 결합하며, 복제 포크 회귀의 활성화 동안 이량체로 전환된다. 또한 특정 가닥에서 WRN의 헬리케이스 활성을 선택적으로 억제함으로써, WRN의 활성 이량체가 반복적 풀림과 복제 포크 회귀에 ATP 가수분해의 에너지를 어떻게 서로 다르게 사용하는지 규명한다.

Rho는 세균에서 일반 전사 종결 인자이지만, 작용 기전의 여러 측면은 아직 불명확하다. RNA 중합효소(RNAP)와 Rho의 초기 상호작용(추격(catch-up) 및 대기(stand-by) 전(前)종결 모델), RNA 전사체의 종결적 방출(RNA 절단; RNA shearing, RNAP의 과도한 전위; hyper-translocation 또는 변위; displacing, 그리고 알로스테릭 모델), 그리고 종결 이후의 결과(RNAP가 DNA에서 분리되는지 혹은 결합된 채로 남는지)에 대해서는 다양한 모델이 제안되어 왔다. 본 연구에서는 E. coli Rho가 매개하는 전사 종결에서 이 세 단계를 단일 분자 형광 분석으로 연구하였다. 그 결과, 각 단계에 대해 이전에 제안되었던 서로 다른 기전들이 공존하되, 서로 다른 시간 척도에서 일어나며 특정한 결과로 귀결되는 경향이 있음을 확인하였다. 우리의 결과는 세 가지 운동학적으로 구별되는 경로가 존재함을 시사한다: (1) 추격 모드는 먼저 DNA 위에서 RNAP 재활용을 위한 RNA 절단을 유도하고, (2) 이후 전사 복합체의 분해를 위한 RNAP 변위를 유도한다; (3) 마지막 종결은 일반적으로 대기 모드가 선행된 뒤 변위를 통해 일어난다. 이 세 경로 모델은 종결 기전에 관한 현재의 논쟁을 조화시키는 데 도움이 될 수 있을 것이다.

다중 핵산 바이오마커의 신속하고 정밀한 검출은 임상적으로 활용 가능한 분자진단법의 개발에 있어 매우 중요하다. 바이오마커 검출의 분석적 특이성은 단일 분자 탐침(probe) 결합 동역학에 대한 정보를 활용함으로써 크게 향상될 수 있다. 그러나 기존의 단일 분자 형광 방법은 검출 탐침이 표적에 결합하는 속도가 느려 바이오마커당 최대 10분이 소요된다. 짧은 시간 내에 다중 바이오마커에 대한 고처리량 프로파일링을 가능하게 하기 위해서는 더 빠른 검출 기술이 필수적이다. 본 연구에서는 (Quenching-based Fluorescence In-Situ Hybridization)을 도입하였으며, 이 기술은 핵산 바이오마커를 아초(sub-second) 시간대에 검출할 수 있어, 종전에 보고된 방법들에 비해 600배 이상 빠른 속도를 달성한다. Q-FISH를 사용하여, 고도로 상동성이 높은 miRNA를 신속하게 구별하는 것과 더불어 내인성 miRNA의 정밀한 정량을 입증하였다.

증식하는 세포에서 유전적 완전성을 유지하기 위해서는 DNA 복제, 염색체 분리, 세포질 분열(cytokinesis)에서의 절단(abscission)에 대한 조절이 상호 협동적으로 이루어져야 한다. 염색체-미세소관 상호작용은 유사분열을 조절하는 반면, 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)과 Myosin IIA 간의 상호작용은 세포질 분열에서의 절단을 지시한다. 이 과정은 복제된 유전체가 두 딸세포로 동일하게 분배되기 위해 필수적이며, 염색체 분리의 축(axis)에 수직한 방향으로 일어난다. 그러나 미세소관에 의해 구동되는 유사분열과 액틴과 연관된 세포질 분열(cytokinesis)이 정밀하게 어떻게 조율되는지에 대한 기전은 아직 충분히 이해되지 않았다. 본 연구는 키네신 유사 단백질(kinesin-like protein)인 KIF18A가 키네토코어-미세소관 역학을 세포질 분열 축 형성과 연결하는 역할을 수행함을 보여준다. KIF18A의 위치는 세포분열 주기 동안 변화하는데, 염색체 정렬(congression) 시기의 중기(metaphase) 판에서 시작하여 후기 anaphase 말기의 중앙 방추체(central spindle)로 이동하고, 마침내 텔로페이즈(telophase)에서는 방추체 중간체(spindle midbody)로 이동한다. KIF18A의 고갈(depletion)은 염색체 정렬 실패와 후기(anaphase) 진입의 지연을 초래한다. 특히, KIF18A가 없는 상태에서 분열을 진행하려는 세포에서는 중앙 방추체(central spindle)의 평행 구조(parallel structure)에 교란이 발생하여, KIF23(키네신 유사 단백질, KIF23; 또한 MKLP1로 알려짐) 및 Rac GTPase 활성화 단백질 1(Rac GTPase-activating protein 1; RACGAP1)과 같은 중앙spindlin 복합체의 잘못된 위치설정을 유발한다. 이러한 교란은 절단 고랑(cleavage furrow) 형성을 저해하여 불완전한 세포질 분열을 초래하고 단핵 또는 이핵 세포의 형성을 유도한다. 우리의 결과는 KIF18A가 후기 anaphase 동안 중앙 방추체의 공간적·시간적 조립을 조절함으로써 염색체 정렬과 세포질 분열을 조율하는 데 필수적임을 시사한다.

핵산과 단백질은 다양한 질환에서 진단, 예후 및 치료 모니터링에 사용되는 핵심 바이오마커이다. 전통적으로 이러한 바이오마커는 표적 또는 신호 분자의 증폭 이후 앙상블 수준에서 확인되어 왔다. 그러나 이러한 방법들은 저감도, 저특이도, 처리량의 한계, 그리고 부정확한 정량화 등 분자진단 분야의 현대적 과제를 해결하는 데 있어 제한점을 가진다. 이러한 한계를 극복하기 위해 단일 분자 수준의 감도를 제공하는 다양한 분석 기법들이 개발되었다. 본 연구의 목적은 단일 분자 수준의 감도로 핵산과 단백질을 검출하기 위한, 역사적으로 주목할 만하고 잠재적으로 유망한 분석 기법들을 간결하게 개관하는 데 있다. 특히 액체생검(liquid biopsy)에서의 적용 가능성에 초점을 맞추어, 각 기법의 장점과 약점을 구분하고, 바이오마커 분석을 혁신할 수 있는 역량에 대한 통찰을 제공하며, 보다 고도화된 기술을 위한 토대를 마련하고자 한다.