(1) 1차년도(2021) - 질병 코호트 구축과 전장엑솜분석(Whole Exom Sequencing) - IRB 승인 - 구강방사선 및 임상검사를 통해 정확한 질병 표현형을 확인 가능한 법랑질형성부전 환자군 30명을 진단 및 모집하여 연구를 위한 코호트를 구축. - 타액 샘플 채취: ORAgene kit(OG-500)를 통해 법랑질 형성부전증 환자의 타액으로 DNA 샘플을 얻음. - 엑솜 염기서열을 분석은 3 ug의 genomic DNA에서 엑솜 분리 키트를 사용하여 전체 유전체 중 단백질을 코딩하는 엑손 부위만을 선별적으로 분리. - 분리된 DNA 조각들을 SOLiD 차세대 염기서열 분석기를 이용하여 대량의 염기서열을 분석. - 분석된 염기서열은 인간의 표준 염기서열과 비교하여 유전변이형의 종류와 빈도를 조사. - 1,000 게놈 프로젝트 데이터베이스를 통해 본 연구의 WES 결과를 비교하고 질병관리본부의 안산 코호트와 본 연구의 WES 결과를 비교분석하여 후보 유전자 수를 줄여나가는 방향으로 연구를 진행. (2) 2차년도(2022) - 생물 정보학(Bioinformatics); Gene Set Enrichment Analysis 분석 - WES 에서 얻은 초기 결과를 annotation을 통해 줄인 후보 유전자 변이 군을 대상으로 기능적 유전자군을 밝히기 위해 GSEA 를 시행 - 후보 유전자군의 모든 유전자들의 발현 패턴에 대해 순위(rank)를 매겨서 정렬한 후, 지정된 gene set에 포함되어 있는 모든 유전자들이 특정 영역에 몰려서 나타날 확률이 어느 정도인지를 Kolmogorov-Smirnov statistic 을 이용하여 계산함. - GSEA는 정의된 유전자 군에서 통계적으로 상관성 있는 발현 양상을 보이는 유전자들은 서로 군집화 되며 그렇지 않은 유전자들은 멀리 떨어지게 되는데, GSEA는 이렇게 군집화되어 해당 생물학적인 현상(pathway, GO 등)을 가장 잘 대표할 수 있는 유전자들(leading edge subset)을 선별해 줌. - 진단모듈을 만들기 위해 GSEA로 후보 유전자 변이형을 기능적 유전자 군으로 나누는 병리학적 의미는 세포 내에서 생물학적 기능이 수행되는 단위는 개별 gene이 아니라 group of genes (module)임을 착안 함. - 서로 다른 gene에서 발견된 genetic mutation이라고 하더라도 변이가 생긴 유전자들이 같은 pathway에 속하거나 같은 기능을 하는 protein complex에 속해 있다면, 두 mutation 모두 같은 질환에 영향을 미칠 수 있음. - 서로 다른 gene 사이의 관계를 생물학적 network 차원에서 분석하면, 그 질병과 관계있는 생물학적 모듈 (biological pathway)을 찾을 수 있음. - 이러한 모듈을 기반으로 하는 진단 모듈을 만들면 환자마다 다를 수 있는 유전변이 결과를 넘어서 유전자 수준의 변이를 통한 생물학적 지표 기반 진단 모듈을 넘어선 기능적으로 연관된 유전자군 기반 진단모듈로서의 역할을 기대 할 수 있는 정밀의학이 가능. - 3차년도 검증을 위한 30명의 환자군 모집 (3) 3차년도(2023) - 진단 모듈 검증 - 1차년도와 다른 2년차에 모집한 독립된 코호트 30명의 환자군에서 DNA 샘플 분석과 생물정보학적 분석을 시행 독립적인 환자 그룹을 통해 바이오 마커의 재현성 검증 및 질병 연관성 분석의 정밀성 확보 - 두 개의 다른 코호트에서 얻은 후보 유전자군을 비교분석 특히 GSEA를 통해 공통적으로 묶이는 기능적 유전자군을 기반으로 모듈을 생성할 수 있음. 단일 유전자 비교와 모듈기반 바이오 마커 그룹의 비교 분석을 통한 검증 – 독립적으로 얻은 코호트 군에서 3차년도까지 연구를 통해 개발한 모듈상의 유전자 변이형과 대조함을 통해서 법랑질 형성부전 바이오 마커 유용성 최종검증.

(1) 1차년도(2021) - 질병 코호트 구축과 전장엑솜분석(Whole Exom Sequencing) - IRB 승인 - 구강방사선 및 임상검사를 통해 정확한 질병 표현형을 확인 가능한 법랑질형성부전 환자군 30명을 진단 및 모집하여 연구를 위한 코호트를 구축. - 타액 샘플 채취: ORAgene kit(OG-500)를 통해 법랑질 형성부전증 환자의 타액으로 DNA 샘플을 얻음. - 엑솜 염기서열을 분석은 3 ug의 genomic DNA에서 엑솜 분리 키트를 사용하여 전체 유전체 중 단백질을 코딩하는 엑손 부위만을 선별적으로 분리. - 분리된 DNA 조각들을 SOLiD 차세대 염기서열 분석기를 이용하여 대량의 염기서열을 분석. - 분석된 염기서열은 인간의 표준 염기서열과 비교하여 유전변이형의 종류와 빈도를 조사. - 1,000 게놈 프로젝트 데이터베이스를 통해 본 연구의 WES 결과를 비교하고 질병관리본부의 안산 코호트와 본 연구의 WES 결과를 비교분석하여 후보 유전자 수를 줄여나가는 방향으로 연구를 진행. (2) 2차년도(2022) - 생물 정보학(Bioinformatics); Gene Set Enrichment Analysis 분석 - WES 에서 얻은 초기 결과를 annotation을 통해 줄인 후보 유전자 변이 군을 대상으로 기능적 유전자군을 밝히기 위해 GSEA 를 시행 - 후보 유전자군의 모든 유전자들의 발현 패턴에 대해 순위(rank)를 매겨서 정렬한 후, 지정된 gene set에 포함되어 있는 모든 유전자들이 특정 영역에 몰려서 나타날 확률이 어느 정도인지를 Kolmogorov-Smirnov statistic 을 이용하여 계산함. - GSEA는 정의된 유전자 군에서 통계적으로 상관성 있는 발현 양상을 보이는 유전자들은 서로 군집화 되며 그렇지 않은 유전자들은 멀리 떨어지게 되는데, GSEA는 이렇게 군집화되어 해당 생물학적인 현상(pathway, GO 등)을 가장 잘 대표할 수 있는 유전자들(leading edge subset)을 선별해 줌. - 진단모듈을 만들기 위해 GSEA로 후보 유전자 변이형을 기능적 유전자 군으로 나누는 병리학적 의미는 세포 내에서 생물학적 기능이 수행되는 단위는 개별 gene이 아니라 group of genes (module)임을 착안 함. - 서로 다른 gene에서 발견된 genetic mutation이라고 하더라도 변이가 생긴 유전자들이 같은 pathway에 속하거나 같은 기능을 하는 protein complex에 속해 있다면, 두 mutation 모두 같은 질환에 영향을 미칠 수 있음. - 서로 다른 gene 사이의 관계를 생물학적 network 차원에서 분석하면, 그 질병과 관계있는 생물학적 모듈 (biological pathway)을 찾을 수 있음. - 이러한 모듈을 기반으로 하는 진단 모듈을 만들면 환자마다 다를 수 있는 유전변이 결과를 넘어서 유전자 수준의 변이를 통한 생물학적 지표 기반 진단 모듈을 넘어선 기능적으로 연관된 유전자군 기반 진단모듈로서의 역할을 기대 할 수 있는 정밀의학이 가능. - 3차년도 검증을 위한 30명의 환자군 모집 (3) 3차년도(2023) - 진단 모듈 검증 - 1차년도와 다른 2년차에 모집한 독립된 코호트 30명의 환자군에서 DNA 샘플 분석과 생물정보학적 분석을 시행 독립적인 환자 그룹을 통해 바이오 마커의 재현성 검증 및 질병 연관성 분석의 정밀성 확보 - 두 개의 다른 코호트에서 얻은 후보 유전자군을 비교분석 특히 GSEA를 통해 공통적으로 묶이는 기능적 유전자군을 기반으로 모듈을 생성할 수 있음. 단일 유전자 비교와 모듈기반 바이오 마커 그룹의 비교 분석을 통한 검증 – 독립적으로 얻은 코호트 군에서 3차년도까지 연구를 통해 개발한 모듈상의 유전자 변이형과 대조함을 통해서 법랑질 형성부전 바이오 마커 유용성 최종검증.