최근 일본뇌염바이러스 유전자형 5(JEV5)의 출현은 제한적인 백신 효능에 대한 우려를 불러왔다. 본 연구에서는 한국의 한 분리주인 K15P38 균주를 기반으로, 세균 인공염색체(bacterial artificial chromosome, BAC) 시스템을 이용하여 JEV5의 전장 감염성 cDNA 클론을 구축하였다. 이로부터 얻어진 클론은 복제능을 갖는 바이러스의 회수를 가능하게 했으며, 엔지니어링된 침묵 돌연변이를 통해 모균주와는 유전적으로 구별되었다. 적용 범위를 확장하기 위해 바이러스 유전체에 나노루시퍼레이스(nanoluciferase)와 향상된 초록형 형광단백질(enhanced green fluorescent protein)을 도입하여, 복제 추적에 적합한 리포터 바이러스를 생성하였다. 두 종류의 리포터 바이러스는 바이러스 복제의 실시간 정량을 지지했으며, 항바이러스 화합물 스크리닝에 유용함을 보여주었다. 뉴클레오사이드 유사체인 NITD008을 이용한 항바이러스 평가에서, 리포터 분석과 고전적 플라크 분석 간의 EC₅₀ 값은 일관된 결과를 보였다. 이러한 결과는 JEV5를 연구하기 위한 역유전학 플랫폼을 제공하며, 유전자형 특이적 백신 및 항바이러스 연구에 적용 가능함을 시사한다.

배경: 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)는 사람에서 중증 호흡기 질환을 유발하며, 치명률은 약 35%로 공중보건에 상당한 위협이 된다. 현재 승인된 백신 또는 항바이러스제가 부재하다는 점은 질병의 유행과 확산을 통제하는 데 있어 장애 요인이다. 방법: 본 연구에서는 올바른 단백질 당화(glycosylation) 양상을 유지하는 데 유리한 포유류 발현 시스템을 사용하여 키메라 MERS-CoV 바이러스 유사 입자(VLPs)를 제작하고, 이를 마우스에서 면역원성과 보호 효능을 평가하였다. 결과: 웨스턴 블롯 및 냉동전자현미경(cryo-electron microscopy) 분석을 통해, MERS-CoV VLP는 MERS-CoV 스파이크(S), 엔벨로프, 막(membrane) 및 쥐 간염 바이러스 뉴클레오캡시드 유전자를 공동 형질감염(co-transfected)한 세포에서 효율적으로 생성됨을 확인하였다. 또한 인체 디펩티딜 펩티다제 4(dipeptidyl peptidase 4) 노크인(knock-in) C57BL/6 동계(congenic) 마우스 모델에서 이들의 백신으로서의 능력을 평가하였다. MERS VLP로 면역한 마우스는 바이러스 중화 활성을 갖는 S 특이적 항체를 생성하였다. 더 나아가, MERS-CoV VLP 면역은 마우스에 적응된(mouse-adapted) 치명적 MERS-CoV 도전(challenge)에 대해 완전한 보호를 제공하였고, 폐에서의 바이러스 제거를 향상시켰다. 결론: 전반적으로, 본 자료는 MERS-CoV VLP가 우수한 면역원성을 가지며, 유망한 백신 후보임을 보여준다.

본 연구에서는 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 복제에 관여하는 기전과 자가포식 플럭스(autophagic flux) 간의 상관관계를 조사하였다. 본 연구에서 PEDV가 복제되는 동안, 감염 후 24시간(hpi)까지 LC3-II 생성이 유의하게 유도됨을 확인하였다. 흥미롭게도 LC3-II 생성이 유의하게 증가하였음에도 불구하고, p62 축적이 동시에 더 크게 나타났다. 라파마이신으로 전처리하면 PEDV 복제가 유의하게 증가하였으나, 자가리소좀(autolysosome) 형성은 감소하였다. 이러한 결과는 ATG5/ATG12 및 LAMP1/LAMP2의 평가를 통해 확인되었다. 종합하면, 우리는 PEDV 감염이 복제 과정에서 자가포식소체(autophagosome) 형성은 유도하되 자가리소좀 형성은 억제함을 결론내린다.

최근 일본뇌염바이러스 유전자형 5(JEV5)의 출현은 제한적인 백신 효능에 대한 우려를 불러왔다. 본 연구에서는 한국의 한 분리주인 K15P38 균주를 기반으로, 세균 인공염색체(bacterial artificial chromosome, BAC) 시스템을 이용하여 JEV5의 전장 감염성 cDNA 클론을 구축하였다. 이로부터 얻어진 클론은 복제능을 갖는 바이러스의 회수를 가능하게 했으며, 엔지니어링된 침묵 돌연변이를 통해 모균주와는 유전적으로 구별되었다. 적용 범위를 확장하기 위해 바이러스 유전체에 나노루시퍼레이스(nanoluciferase)와 향상된 초록형 형광단백질(enhanced green fluorescent protein)을 도입하여, 복제 추적에 적합한 리포터 바이러스를 생성하였다. 두 종류의 리포터 바이러스는 바이러스 복제의 실시간 정량을 지지했으며, 항바이러스 화합물 스크리닝에 유용함을 보여주었다. 뉴클레오사이드 유사체인 NITD008을 이용한 항바이러스 평가에서, 리포터 분석과 고전적 플라크 분석 간의 EC₅₀ 값은 일관된 결과를 보였다. 이러한 결과는 JEV5를 연구하기 위한 역유전학 플랫폼을 제공하며, 유전자형 특이적 백신 및 항바이러스 연구에 적용 가능함을 시사한다.

배경: 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)는 사람에서 중증 호흡기 질환을 유발하며, 치명률은 약 35%로 공중보건에 상당한 위협이 된다. 현재 승인된 백신 또는 항바이러스제가 부재하다는 점은 질병의 유행과 확산을 통제하는 데 있어 장애 요인이다. 방법: 본 연구에서는 올바른 단백질 당화(glycosylation) 양상을 유지하는 데 유리한 포유류 발현 시스템을 사용하여 키메라 MERS-CoV 바이러스 유사 입자(VLPs)를 제작하고, 이를 마우스에서 면역원성과 보호 효능을 평가하였다. 결과: 웨스턴 블롯 및 냉동전자현미경(cryo-electron microscopy) 분석을 통해, MERS-CoV VLP는 MERS-CoV 스파이크(S), 엔벨로프, 막(membrane) 및 쥐 간염 바이러스 뉴클레오캡시드 유전자를 공동 형질감염(co-transfected)한 세포에서 효율적으로 생성됨을 확인하였다. 또한 인체 디펩티딜 펩티다제 4(dipeptidyl peptidase 4) 노크인(knock-in) C57BL/6 동계(congenic) 마우스 모델에서 이들의 백신으로서의 능력을 평가하였다. MERS VLP로 면역한 마우스는 바이러스 중화 활성을 갖는 S 특이적 항체를 생성하였다. 더 나아가, MERS-CoV VLP 면역은 마우스에 적응된(mouse-adapted) 치명적 MERS-CoV 도전(challenge)에 대해 완전한 보호를 제공하였고, 폐에서의 바이러스 제거를 향상시켰다. 결론: 전반적으로, 본 자료는 MERS-CoV VLP가 우수한 면역원성을 가지며, 유망한 백신 후보임을 보여준다.

본 연구에서는 돼지 유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 복제에 관여하는 기전과 자가포식 플럭스(autophagic flux) 간의 상관관계를 조사하였다. 본 연구에서 PEDV가 복제되는 동안, 감염 후 24시간(hpi)까지 LC3-II 생성이 유의하게 유도됨을 확인하였다. 흥미롭게도 LC3-II 생성이 유의하게 증가하였음에도 불구하고, p62 축적이 동시에 더 크게 나타났다. 라파마이신으로 전처리하면 PEDV 복제가 유의하게 증가하였으나, 자가리소좀(autolysosome) 형성은 감소하였다. 이러한 결과는 ATG5/ATG12 및 LAMP1/LAMP2의 평가를 통해 확인되었다. 종합하면, 우리는 PEDV 감염이 복제 과정에서 자가포식소체(autophagosome) 형성은 유도하되 자가리소좀 형성은 억제함을 결론내린다.

마우스 간염 바이러스(MHV)의 스파이크 유전자에서의 결실(deletion)은 생물학적 특성이 다양한 여러 변이체를 생성하며, 이는 바이러스 병인(병태생리)에 있어서 스파이크 유전자의 중요성을 부각한다. 본 연구에서는 스파이크 유전자의 고변이 가변부위(HVR)에 결실이 있는 JHM-X 균주를, 스파이크 유전자가 전체적으로 존재하는 cl-2 균주와 비교하여 특성화하였다. 두 균주가 유도한 세포병변효과(CPE)를 통해 지연 뇌종양(DBT) 세포에서 cl-2가 생성하는 CPE의 크기가 JHM-X가 생성하는 CPE보다 현저히 큼을 확인하였다. 따라서 이러한 결과는 배양 세포에서 cl-2가 JHM-X보다 더 큰 융합(fusion) 활성을 보이는 이유를 설명하며, 스파이크 단백질의 결실 부위가 융합 활성 차이에 관여할 것으로 추정된다. 융합 활성과는 대조적으로, 바이러스 성장 동역학을 비교한 결과 JHM-X의 역가(titer)는 cl-2에 비해 약 100배 높았다. 우리는 스파이크 단백질의 결실 부위가 융합 활성 차이에 관여하는 반면, 동일한 스파이크 단백질 발현 수준 하에서 cl-2는 JHM-X보다 유의하게 더 높은 루시퍼레이스(luciferase) 활성을 생성함을 확인하였다. 그러나 이러한 성장 차이의 원인은 아직 알려져 있지 않다. 전반적으로, 스파이크 유전자의 HVR에서의 결실이 두 균주 간 융합 활성 차이에 관여할 수 있음을 발견하였다.

먼저, PEDV 스파이크 단백질(SP)의 수용체 결합 도메인(RBD)에 결합하는 결합 친화력을 갖는 4종의 Fv-항체를 Fv-항체 라이브러리에서 스크리닝하였다. 이어서 도킹 시뮬레이션을 통해 PEDV RBD 상에서 Fv-항체의 결합 부위(항원성 부위)를 분석하였으며, 스크리닝된 Fv-항체 각각의 결합 서열은 서로 상당히 떨어져 분포하는 것으로 확인되었다. PEDV 백신의 면역원성 서열을 발현하기 위해, PEDV RBD 상의 결합 부위 사이의 공백을 비면역원성 서열 모듈로 채웠고, 백신용 면역원성 서열을 단일 단백질로 제조할 수 있었다. 면역원성 서열은 페리틴 분자와 함께 발현하였으며, 24개의 페리틴 분자의 자가조립을 통해 구형 모양의 나노입자에서 페리틴 복합체 백신을 제조하였다. 각 면역원성 서열은 페리틴 복합체 백신의 외부 표면에 발현되었고, 이를 마우스에 주사하였다. 주사된 페리틴 복합체 백신은 IgG 아형 분류, 백신 관련 사이토카인의 분비, CD4+/CD8+ T 세포의 프로파일을 분석함으로써 백신 관련 면역 반응을 활성화하였다. 마지막으로, 세포 기반 감염 분석을 통해 PEDV 감염을 예방하기 위한 항혈청의 중화 활성을 분석하였다. 중화 활성은 PEDV 백신의 중화 활성에 대한 공식 지침에 따라 평가하였다. 4종의 페리틴 복합체는 양성 및 음성 대조군 사이의 중화 활성을 보였으며, 페리틴 복합체 2는 양성 대조군과 유사할 정도로 높은 중화 활성을 나타냈다.

, 단백질 정제 및 재접힘(refolding), 그리고 이러한 최적화 기법을 EDIII ferritin 나노입자의 정제에 적용하였다. 그 결과, 정제된 DENV2 EDIII 및 EDIII 인간 ferritin heavy chain 나노입자를 무첨가제(adjuvant) 없이 BALB/c 마우스에 근육 내(intramuscularly) 면역화하였으며, 면역원성은 IgG ELISA 및 혈청 중화(serum-neutralizing) 분석으로 평가하였다. 정제되고 적절히 재접힘되었으며 응집체가 없는 EDIII 및 EDIII ferritin 단백질을 얻었고, 전자현미경을 이용하여 ferritin 나노입자를 확인하였다. 마우스 혈청의 면역원성을 분석한 결과, EDIII ferritin은 EDIII 면역화 마우스에 비해 유의하게 더 높은 IgG 반응과 중화 활성을 유도하였다. IgG ELISA 결과는 EDIII ferritin이 EDIII보다 유의하게 높은 IgG 역가(O.D.: 1.8)를 유도할 수 있음을 확인하였는데, EDIII는 O.D.: 0.05였다. 또한 EDIII ferritin은 중화 역가 1:68을 생성한 반면, EDIII 단백질은 평균 역가 1:16을 생성하였으며, 이는 바이러스를 90% 억제한 혈청 희석 배수이다. 최종 면역화 후 2개월째에 채취한 혈청을 이용하여 면역 반응의 지속성을 분석하였고, 그 결과 EDIII ferritin이 해당 기간 전반에 걸쳐 일정한 면역성을 유도함을 확인하였다.

) 유전자는 pEGFP-C1 벡터에서 구성되었다. 또한, 두 개의 절단 변이체인 ORF3-N(1–98 아미노산[aa])과 ORF3-C(99–224 aa)가 동일한 벡터에 삽입되었다. ORF3 발현의 결과는 ORF3가 발현 초기에는 세포질에 국소화되는 양상을 보였으나, 형질전환 후 12시간이 경과하면 ORF3가 핵 주위에 축적되었고 특히 ORF3-N에서 두드러졌다. 이는 염색체 응축과 형태학적 왜곡을 유발하여 결국 세포 사멸로 이어졌다. GFP만 발현하는 자생 세포와 비교하였을 때, ORF3wt 유도에 의한 치명성은 기준치보다 6.61% 높았으며, ORF3-C 발현은 세포 사멸의 중등도 증가(0.64%)를 초래하였다. 치명성의 변화는 ORF3-N에서 가장 크게 나타났는데, 220.32% 증가하였다. 따라서 ORF3 유전자는 핵 손상을 일으키고 세포 형태를 왜곡하며 세포 사멸을 유발하는 단백질을 암호화한다는 점을 추정할 수 있었다. 또한, 단백질의 역할은 막관통 도메인으로 구성된 N-말단 도메인에 내재되어 있을 가능성이 있다. 이러한 결과는 숙주에서 ORF3 유전자 발현의 중요성을 뒷받침하며, ORF3와 숙주 사이의 기전적 상호작용 및 PEDV와 기타 코로나바이러스에서의 병원성에 대한 가능한 역할을 추가로 탐색하기 위한 기초적인 통찰을 제공한다.