(1) 1차년도 연구 내용 ○ 주요 축종 발달단계 별 세포주 구축 ① 한우: 한우 송아지 일령 (7일, 14일, 28일, 12개월) 별 근육/지방/중간엽줄기세포 추출 및 배양 최적화 기술 수립. ② 돼지: 돼지의 일령(생후 1일, 7일, 14일, 28일령)별 근육/지방/중간엽줄기세포 추출 및 배양 기술 확립. 돼지의 성장 단계(신생자돈, 포유자돈, 이유자돈, 육성돈, 비육돈)별 근육/지방/중간엽줄기세포 추출 및 배양 기술 확립. ③ 닭: 식용으로 활용되는 우수형질 육계의 일령(발생전 1일, 생후 3일, 5주령)별 근육 줄기세포의 추출 및 배양기술 확립. ○ 축종 맞춤 부위별 줄기세포주 구축 ① 한우: 한우 연령별 등심, 안심, 갈비, 채끝 등 다양한 조직으로부터 근육 조직 채취 및 줄기세포 회수율을 비교 분석함. ② 돼지: 돼지 부위(목심, 등심, 허벅지)별 근육줄기세포 추출, 귀 피부조직의 섬유아세포(Fibroblast) 추출, 피하지방조직의 지방줄기세포 추출 및 배양 기술 확립. 골수, 지방조직, 탯줄의 Wharton’s Jelly에서 중간엽줄기세포 추출 및 배양 기술 확립 ③ 닭: 닭의 부위(가슴살, 다리살)별 근육줄기세포 추출 및 배양. - 다리 뼈 조직에서 골수줄기세포(Bonemarrow stem cells)추출, 피하지방조직에서 지방유래 중간엽줄기세포 추출 및 배양 ○ 우수형질 보유 개체의 줄기세포주 구축 ① 한우: 유전능력정보 분석을 통해 12개월의 추정치 A 등급 (체중, 도체중, 등심단면적 등) 조사를 통해 우수 형질의 한우 송아지로부터 각 근육 조직을 채취 및 배양. ② 돼지: 우수 형질 돼지인 3원 교잡종인 LYD(Landrace x Yorkshire x Duroc)과 제주흑돼지 품종의 줄기세포주 구축(다산육종과의 협약서 체결). 그 외 국내에서 많이 사육되고 있는 돼지 품종 유래 줄기세포와 우수형질 돼지유래 세포와 비교분석. ③ 닭: 닭에서의 우수형질인 근육발달, 고기 풍미, 낮은 포화지방산/높은 불포화지방산을 보이는 토종닭 3원 교잡종으로 우리맛닭1호, 우리맛닭2호를 이용 줄기세포의 채취 및 배양. ○ FBS 대체재를 활용한 배양기술 개발 - Chick embryo extract(CEE)를 이용한 배양 기법 수립. (2) 2차년도 연구 내용 ○ 세포주별 줄기세포 특성 분석 - 근육/지방/중간엽 줄기세포 특이적 마커 단백질(Western blot, ICC) 및 RNA-seq 및 scRNA-seq 분석 기법을 이용하여 근육 조직 구성과 관련된 유전자 발굴 및 분석. - 줄기세포 안전성(종양원성) 확보를 위한 줄기세포의 장기배양시 유전자 돌연변이 생성 유무 분석. ○ 근육줄기세포 증식 및 유지 인자 발굴 - 근육줄기세포 줄기성 유지에 있어서 p38-MAPK 억제 소분자 화합물을 이용한 근육줄기세포 증식 및 유지 향상 기술 수립. ○ 한우, 돼지, 닭 세포주 특성 분석을 통한 배양육 적용 최적의 세포주 확립 ① 역분화 만능줄기세포(iPSCs, EPSCs)주 수립 (한우, 돼지, 닭) - 유도만능줄기세포(IPSCs)와 확장만능줄기세포(EPSC) 수립(Non-integrating reprogramming 방법 이용) - 수립된 역분화 만능줄기세포의 만능성 분석 ② 배아줄기세포(ESCs)주 수립 (돼지 & 닭) - 돼지 배반포의 내부세포덩어리(ICM), 닭 유정란 X stage로부터 blastoderm cell 분리하여 배아줄기세포 수립 및 특성 분석 ③ 배양육 생산을 위한 불멸화세포주(immortalized cell line) 수립 - 다양한 세포주(섬유아세포, 근육줄기세포, 지방줄기세포, 중간엽줄기세포)를 이용한 자연적으로 불멸화된 불멸화세포주 수립 ○ 줄기세포주 은행 (3) 3차년도 연구 내용 ○ 세포주 증식 능력 향상 기술 개발 ① 근육분화 가속화 줄기세포(근육 분화가 향상된 세포주) 수립 - CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 주요 가축의 Myostatin 넉아웃 세포를 수립 ② 3D 배양 시스템 개발